由于农业施肥的不合理使用和生活污水、工业污水、养殖污水、农田径流的直接排放，大量氮、磷等营养物质被排入自然水体，对水生生态系统的结构和功能构成严重威胁。目前，污水处理厂被认为在控制污染和改善水质方面起着举足轻重的作用。然而，经过生物处理后的污水处理厂废液中仍有约10-15 mgL−1的氮残留，如果不经任何深度处理直接排放，可能导致富营养化。因此，迫切需要有效的污水处理厂废液深度脱氮技术。本文以新型生物高分子3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）和PHBV-锯末共混合体为载体，构建了固相反硝化系统，通过中试试验对污水处理厂（WWTPs）废液进行深度脱氮，并通过宏基因组测序分析共混物碳源对微生物群落结构、功能和代谢途径的影响。与PHBV系统相比，PHBV-锯末共混物系统的反硝化处理效果更优：NO3−-N去除率更高（96.58%）、DOC释放量（9.00±4.16 mgL−1）和NH4+-N积累量（0.37±0.32 mgL−1）更低。宏基因组分析证实了两个系统间微生物群落结构存在显著差异，并发现了四种厌氧氨氧化菌的存在。与PHBV系统相比，PHBV-锯末共混物系统的利用降低了产NH4+-N相关酶编码基因的相对丰度，增加了参与厌氧氨氧化相关酶编码基因的相对丰度，这有助于降低废液中的NH4+-N的含量。另外，在PHBV-锯末共混物系统中，产生电子的糖酵解代谢过程的酶编码基因的相对丰度更高。在PHBV-锯末共混物系统中，多种木质纤维素酶编码基因显著富集，保证了该系统的稳定供碳和连续运行。本研究结果有望为固相反硝化技术的推广提供理论依据和数据支持。
论文ID
原名：Metagenomic analyses of microbial structure and metabolic pathway in solid-phase denitrification systems for advanced nitrogen removal of waste water treatment plant effluent: Apilot-scale study
译名：固相反硝化系统中微生物结构及代谢途径的宏基因组分析：基于污水处理厂废水深度脱氮的中试研究
期刊：Water Research
IF：9.130
发表时间：2021.3.17
通讯作者：吴为中
通讯作者单位：北京大学环境科学与工程学院环境科学系
实验设计
本研究在宁波南区污水处理厂，以PHBV和PHBV-锯末共混合物为生物膜载体和碳源，构建固相反硝化系统。具体构建方法为：PHBV和PHBV-锯末共混合体分别与8-10 mm的陶粒以3:7的体积比混合均匀，将混合后的基质填充于高100 cm的多孔支撑盘上，以此建立了两个直径20 cm、高140 cm的圆柱形聚氯乙烯固相反硝化系统。该系统启动阶段，将污水处理厂废液与二沉池活性污泥混合后，以1:1的体积比进入固相反硝化系统，进行生物膜培养。之后每天对固相反硝化系统的水质进行分析，5天后，废液中的NH4+-N和NO3−-N浓度分别低于1.0和2.0 mgL−1时，标志着固相反硝化系统正式启动。该系统共计连续运行150天，1-76天固相脱氮系统的水力停留时间（HRT）为3h，77-150天将HRT降至1.5h，以评估脱氮性能的持久性。测得污水处理厂废液的溶解氧（DO）和pH值分别为4.1-8.0 mgL−1和5.68-6.95。
每两天采集一次进水和出水水样。通过0.45μm醋酸纤维素膜过滤后，分别对水样中的NH4+-N、NO3−-N、NO2−-N、溶解有机碳（DOC）等水质指标进行分析。
在系统稳定运行150天时，分别从PHBV和PHBV-锯末共混物系统中的5个采样点采集生物膜样品，每个采样点取2g均匀混合成一个样本，分别命名为P和PS。每个样本有三个生物学重复。提取相应样品的DNA进行宏基因组测序及分析，以进行微生物群落结构和代谢途径的研究。
结果与讨论
1不同系统的最佳脱氮性能
不同HRT下的脱氮和DOC释放性能见表1。HRT为3h和1.5h下，进水中的NO3−-N的平均浓度分别为9.53±1.43mgL−1和9.94±1.17 mgL−1，仅检测到少量NH4+-N。HRT为3h时，PHBV和PHBV-锯末共混物系统的去除率分别为92.36%和96.64%。在PHBV中掺入锯末，提高了其硝酸盐的去除率，改善了其生物可利用率，有利于微生物的附着和固体有机碳的生物降解。
相较于PHBV-锯末共混物系统，PHBV系统的DOC和NH4+-N浓度更高。PHBV-锯末共混物系统的DOC平均浓度为15.49±12.09 mgL−1，HRT调整至1.5 h后降至9.00±4.16 mgL−1。HRT调整到1.5h后，PHBV和PHBV-锯末共混物系统仍然保持了95.57%和96.58%的有效NO3−-N去除率，表明了固相反硝化系统的稳定运行。PHBV-锯末共混物系统出水中NH4+-N的累积浓度降至0.37±0.32 mgL−1，远低于PHBV系统（1.14±0.37 mgL−1）。
表1. 不同HRT下的固相反硝化系统的脱氮性能
2不同固体碳源对微生物群落结构的影响
通过宏基因组测序，样品分组
P得到的原始数据量为3.96×1010raw bases和2.62×108raw reads，样品分组PS得到的原始数据量为3.75×1010raw bases 和2.49×108raw reads。NR物种注释结果显示：细菌占总物种的97.53%-99.06%，在每个样本中均占优势。PHBV-锯末共混物系统中细菌和病毒的比例显著低于PHBV系统，而古菌和真核生物的比例在PHBV-锯末共混物系统中则具有明显的数量优势。
PHBV系统和PHBV-锯末共混物系统中相对丰度大于1.00%的主要门如图1a所示。分析表明两个系统在门水平上的微生物群落组成存在显著差异。两个系统中均以变形菌门（Proteobacteria）为主，分别占78.96%和50.05%。在PHBV系统中，拟杆菌门（Bacteroidetes）为第二优势菌门（3.63%），其次为厚壁菌门（Firmicutes）（3.27%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（2.87%）、放线菌门（Actinobacteria）（1.37%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（1.24%）和Spirochaetae（1.19%）。在PHBV-锯末共混物系统中，放线菌门（Actinobacteria）是的第二优势菌门（10.61%），其次是绿弯菌门（Chloroflexi）（7.36%）、拟杆菌（Bacteroidetes）（5.33%）、浮霉菌门(Planctomycetes)（2.73%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（2.65%）、厚壁菌门（Firmicutes）（2.34%）、Ignavibacteriae（2.04%）、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)（2.07%）、蓝细菌门（Cyanobacteria）（1.33%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）（1.40%）和广古菌门(Euryarchaeota)（1.36%）。变形菌、拟杆菌、放线菌和绿弯菌广泛存在于城市污水处理系统中，在生物降解中起着重要作用。大多数脱氮细菌隶属于变形菌门，变形菌在反硝化中起着主导作用。放线菌合成的一些酶可以促进植物生物量中多糖或酚类化合物的分解过程。绿弯菌和拟杆菌被认为具有分解大分子的能力，通常在发酵系统中观察到。PHBV-锯末共混物系统中绿弯菌、放线菌和拟杆菌的丰度较高，可能是由于生物量的难降解性所致。值得一提的是，在PHBV-锯末共混物系统中检测到广古菌门，相对丰度为1.36%。玉米秸秆和鸡粪中温发酵系统中主要的菌群是广古菌、拟杆菌和厚壁菌。此外，广古菌门含有丰富多样的产甲烷细菌，它们在厌氧发酵系统中产生甲烷。因此，在PHBV-锯末共混物系统中，一小部分有机物可能通过厌氧发酵转化为甲烷，而不是进行反硝化作用。
PHBV系统和PHBV-锯末共混物系统在属水平上的微生物群落组成如图1b所示。在PHBV系统中，脱氯单胞菌属（Dechloromonas）所占比例最高，达36.91%，其次是脱硫弧菌属（Desulfovibrio）（3.82%）、趋磁螺旋菌属（Magnetospirillum）（2.90%）、Azoarcus（1.56%）、地杆菌属（Geobacter）（1.20%）、Thaurea（1.19%）、Azonexus（1.16%）和Candidatus Accumulibacter（1.08%）。在PHBV-锯末共混物系统中，脱氯单胞菌属（Dechloromonas）的数量最多，占3.00%，其次是Sulfuritalea（2.64%）、缓生根瘤菌属（Bradyrhizobium）（1.96%）、Ignavibacterium（1.81%）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）（1.51%）、Candidatus Accumulibacter（1.46%）、Conexibacter（1.31%）和硝化螺旋菌属（Nitrospira）（1.23%）。脱氯单胞菌属（Dechloromonas）,Thauera,Ignavibacterium和硝化螺旋菌属（Nitrospira）能够代谢氮和芳香化合物，这在污水处理系统中很常见。脱氯单胞菌属（Dechloromonas）是固相反硝化菌，可以利用木质纤维素作为碳源。脱硫弧菌属（Desulfovibrio）普遍存在于厌氧系统中，能够参与DNRA。
图1. PHBV和PHBV-锯末共混物系统在门（a）和属（b）水平上的微生物组成。
PHBV和PHBV-锯末共混物系统中微生物组成的差异分析如图2所示。在前15个门中，只有变形杆菌门（Proteobacteria）和Spirochaetae在PHBV系统中的相对丰度显著较高，而其他门主要分布在PHBV-锯末共混物系统中。前15个属中，脱氯单胞菌属（Dechloromonas）, 脱硫弧菌属（Desulfovibrio）, 趋磁螺旋菌属（Magnetospirillum）,Azoarcus, 地杆菌属（Geobacter）和假单胞菌属(Pseudomonos)在PHBV系统中显著富集。
图2. PHBV和PHBV-锯末共混物系统在门（a）和属（b）水平上微生物组成的差异分析。
星号（∗）表示与对照组的显著差异（单因素方差分析，p<0.05）。
之前的研究表明，PHBV-锯末共混物系统中nirS和amx基因有明显的富集，因此推测该系统中反硝化和厌氧氨氧化可能有共存的现象，这有助于更好地控制氮和溶解有机碳的含量。在本研究中，NR物种注释的结果表明PHBV和PHBV-锯末共混物系统中存在厌氧氨氧化细菌，包括CandidatusBrocadia,Candidatus Kuenenia,Candidatus Scalindua和CandidatusJettenia（图3）。在PHBV-锯末共混物系统中，CandidatusBrocadia是相对丰度最高（0.09%）的一种厌氧氨氧化菌，而其他厌氧氨氧化细菌的相对丰度较低（约为0.03%）。此外，所有检测到的厌氧氨氧化菌在PHBV-锯末共混物系统中的相对丰度明显高于PHBV系统，证实了反硝化作用与厌氧氨氧化的协同作用，PHBV-锯末共混物系统中的厌氧氨氧化活性更高，有利于降低系统出水中累积的NH4+-N。
图3. PHBV与PHBV-锯末共混物系统中厌氧氨氧化细菌丰度的差异分析。
星号（∗）表示与对照组的显著差异（单因素方差分析，p<0.05）。
3不同固体碳源对氮代谢和糖酵解途径的影响
氮代谢相关酶编码基因的相对丰度如图
4所示。在反硝化途径中，编码硝酸还原酶（EC 1.7.5.1）、一氧化氮还原酶（EC 1.7.2.5）和一氧化二氮还原酶（EC 1.7.2.4）的基因在PHBV-锯末共混物系统中的相对丰度显著较高，表明其对硝酸盐的去除效果较好，与出水中较低的NO3−-N相一致。PHBV系统中编码NH4+-N生成的基因固氮酶（EC1.18.6.1）和羟胺还原酶（EC1.7.99.1）基因相对丰度显著增加，导致出水中NH4+-N的积累。在PHBV-锯末共混物系统中，负责调节厌氧氨氧化的肼合酶（EC 1.7.2.7）和肼脱氢酶（EC 1.7.2.8）编码基因的相对丰度显著高于PHBV系统，调节NH4+-N生成的编码基因丰度相对减少，而调节厌氧氨氧化作用的编码基因丰度相对增加，最终导致出水中NH4+-N的积累减少。
图4. 氮代谢和糖酵解关键酶编码基因的相对丰度。
星号（∗）表示与对照组的显著差异（单因素方差分析，p<0.05）。
反硝化微生物通过降解碳源获得电子，保证NO3−-N完全还原为N2。在糖酵解过程中，葡萄糖激酶（GK，EC 2.7.1.2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，EC 1.2.1.59）是催化产生反硝化电子供体的两种重要酶。在糖酵解代谢途径中，编码葡萄糖激酶的基因在PHBV系统中的相对丰度（2.73%）显著高于PHBV-锯末共混物系统的（2.47%）。葡萄糖激酶负责催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，这是碳源代谢的第一步。当固体碳源水解速率过快时，这可能会加速碳源的水解，并导致PHBV系统出水的DOC升高（表1）。PHBV-锯末共混物系统GAPDH编码基因相对丰度（EC 1.2.1.59）为0.18%，显著高于PHBV系统的（0.04%）。GAPDH可催化糖酵解过程中甘油醛-3-磷酸转化为3-磷酸甘油酯，并生成NADH，作为微生物反硝化的电子供体。因此，在PHBV-锯末共混物系统中，为硝酸盐的去除提供更多的电子供体，这与PHBV-锯末共混物系统具有更好的硝酸盐去除性能相一致。
而PHBV系统中磷酸甘油激酶（EC 2.7.2.3）和丙酮酸激酶（EC 2.7.1.40）编码基因的相对丰度（分别为3.49%和3.63%）明显高于PHBV-锯末共混物系统的（分别为2.64%和3.39%）。作为催化ATP生成的关键酶，其编码基因的相对丰度明显较高，可能为PHBV系统中的微生物硝化作用提供更多有效的ATP，而固相反硝化系统中相对较低的DO抑制了微生物硝化作用。
微生物反硝化需要足够的电子来完成硝酸盐异化还原为氮的过程。PHBV-锯末共混物的利用保证了NADH的供应，为微生物脱氮提供了足够的电子。而PHBV系统出水DOC浓度升高，促进了DNRA生物的生长，但抑制了厌氧氨氧化菌的繁殖，并导致出水中NH4+-N的积累。
4不同系统中注释的木质纤维素酶
PHBV系统和PHBV-锯末共混物系统中注释的木质纤维素酶的相对丰度及其差异分析如图5所示。分别对两个系统中的10种木质纤维素酶进行了注释，包括5种纤维素酶（β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、α-葡萄糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶和纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶）、4种半纤维素酶（β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶）、1种木质素水解酶（半乳糖氧化酶）。除纤维二糖磷酸化酶和半乳糖氧化酶外，大部分木质纤维素酶显著富集在PHBV-锯末共混物系统中。表明该系统中木质纤维素的降解更加活跃，不仅提高了资源利用率，而且防止了固相反硝化系统的堵塞，保证了异养反硝化反应稳定的碳源供应。
图5. PHBV与PHBV-锯末共混物系统中注释的木质纤维素酶的相对丰度及其差异。
星号（∗）表示与对照组的显著差异（单因素方差分析，p<0.05）。
结论
以PHBV-锯末共混物为载体的中试规模的固相脱氮系统成功地实现了污水处理厂废液的深度脱氮，其负面影响小于PHBV系统。宏基因组分析表明，在PHBV-锯末共混物系统中，调节NH4+-N产生的编码基因丰度相对减少，而调节厌氧氨氧化作用的编码基因丰度相对增加，最终导致系统出水中NH4+-N积累减少。与PHBV相比，PHBV-锯末共混物系统中GAPDH（EC 1.2.1.59）编码基因的相对亲和力显著提高，促进了微生物的反硝化作用。PHBV-锯末共混物系统中木质纤维素酶编码基因的显著富集表明木质纤维素酶的降解更为活跃，从而保证了碳源的持久供应和固相反硝化系统的稳定运行。本研究首次以PHBV-锯末共混物为载体构建固体反硝化系统，通过中试试验对污水处理厂废液进行深度脱氮，并对该系统中微生物代谢机理进行了研究，为天然生物材料的高效利用以及生物共混合碳源对氮代谢的影响提供了新的思路。
原标题：北大 | Water Research：固相反硝化系统中微生物结构及代谢途径的宏基因组分析：基于污水处理厂废水深度脱氮的中试研究
