随着我国工业化进程的不断加快，工业废水排放量也日益激增，其对水环境的影响程度已不容忽视。特别是高浓度氨氮废水的超标排放，极易造成自然水体富营养化，出现水华和赤潮现象。生化处理是现今应用最广、最经济的污水处理方式，常见工艺包括以活性污泥法为基础的AO，A2/O和MBR等。活性污泥内部微生物在代谢分解污染物时，一方面将污染物中的碳氮物质用于自身生长，另一方面，与其他生物共同组成较为稳定的微生态系统。因此，活性污泥中微生物多样性的研究对优化处理工艺具有重要意义。
然而，由于传统分子生物学技术的限制，分离培养法只能鉴别不足1%的微生物，难以揭示活性污泥中微生物的群落结构和生长机制。近年来，随着分子生物学技术的发展，具有通量高、成本低、灵敏度高、流程自动化等优势的高通量测序技术已广泛应用于污泥微生物的研究，并且在揭示水处理工艺功能菌群方面发挥了重要作用。AO工艺作为重要的活性污泥法工艺之一，具有耗能低、脱氮效果良好、抗冲击负荷能力强等优点，其微生物群落结构动态主要受温度和进水水质等影响。孙豆豆通过对比5℃及10℃下AO工艺中的活性污泥，发现各微生物样品门、纲水平上差异较小，主要纲均为鞘脂杆菌纲和Betaproteobacteria纲，而嗜热丝菌门和脱铁杆菌门等只在5℃的样品中发现。蒙小俊等研究发现，AO工艺处理焦化废水时，其处理效果稳定期好氧段中优势菌门主要为Proteobacteria、Planctomycetes、Acidobacteria、Candidatus、Sacibacteria和Bacteroidetes等，并且Proteobacteria门占主导地位，其相对丰度比例为36.00%~76.98%。邹晓凤等发现在AO工艺处理煤化工废水时，好氧段中微生物的主要菌属为未分类菌属、Nitrospira、Nitrosospira、Azospira、Coxiella和Vampirovibrio等。
此外，在淀粉废水中，氨氮含量较高，碳氮比难以满足微生物正常代谢分解。利用AO工艺解读淀粉厂废水处理效能及微生物群落结构的研究，以及结合实际污水厂及实验室小试装置解读其运行过程中微生物差异性的研究均鲜有报道。基于此，本研究以河北某淀粉工业污水处理厂及实验室AO反应器为研究对象，通过调试AO工艺的运行参数优化水质处理效果;同时利用Miseq测序技术，解析污水厂及实验室AO反应器各阶段微生物群落动态变化;结合ANOVA分析方法，解读污水厂及实验室AO反应器微生物群落结构差异，为淀粉工业废水处理工艺的稳定运行提供技术支撑与理论依据。
1材料与方法
1.1污水站及反应器运行
污泥样品取自河北省某淀粉工业污水处理厂，该厂设计水量15000m3˙d−1，进水主要有3个来源：淀粉厂区废水、维生素B12厂区废水和企业内部生活污水。其中淀粉园区废水量9948m3˙d−1，维生素B12废水量5956m3˙d−1。该站主体工艺为多组改良型AO工艺，进水COD和NH4+-N平均浓度分别为500mg˙L−1和450mg˙L−1。污水站主要设计运行参数：污泥浓度3000mg˙L−1，混合液回流比50%，污泥回流比50%。共监测水质142d，其中第1～60天为前期调试阶段，第61～142天为后期稳定运行阶段。分别于污水厂调试开始时及氨氮去除率稳定在98%时，即第3天取污泥样品，编号为X1(缺氧段)和X2(好氧段)，第132天取污泥样品编号为Z1(缺氧段)和Z2(好氧段)。取样置于冰桶中运回实验室，离心(5min，11000r˙min−1)后称取5g冷冻于−80℃冰箱中，以备DNA提取。
AO反应器如图1所示，其采用有机玻璃制作，主体由进水桶(50L)，缺氧池(A池，1.8L)，好氧池(O池，5.4L)以及沉淀池和蠕动泵组成。接种污泥取自淀粉工业污水处理厂生化池，接种污泥浓度(MLSS)为3000mg˙L−1左右。污水厂污泥取回后，闷曝24h后排出上清液，去除原有污水中的有机成分，在AO工艺溶液体积不变的情况下缓慢进人工配水。为保证实验室AO装置与污水厂可比性，进水COD和氨氮平均浓度分别为500mg˙L−1和450mg˙L−1，人工配水组成：葡萄糖680mg˙L−1，氯化铵440mg˙L−1，磷酸二氢钾100mg˙L−1，七水合硫酸镁100mg˙L−1，七水合硫酸锌0.06mg˙L−1，氯化钙47mg˙L−1，硫酸亚铁40mg˙L−1，硫酸镁40mg˙L−1，并且需添加微量CoCl2˙6H2O和(NH4)6Mo7O24˙4H2O，以保证微生物生长所必需的微量元素[11]。
AO工艺进水及污泥回流均采用蠕动泵控制流量，进水流量初期控制为0.1L˙h−1，因装置反应体积较小，蠕动泵污泥及硝化液回流量较低，故适当提高回流比，使污泥和硝化液回流比分别为200%和100%，初期缺氧段和好氧段溶解氧浓度分别为0.1mg˙L−1和6.5mg˙L−1。水质监测共45d。在实际监测过程中，根据COD浓度变化投加碳源，在污泥驯化过程中及AO反应器脱氮效率稳定在85%时，水质不再发生明显变化，分别在第5天、第20天、第41天取污泥样品150mL，根据时间先后顺序编号W1、W2、W3，离心(5min，11000r˙min−1)后称取5g冷冻于−80℃冰箱中，以备DNA提取。
图1实验室AO反应器流程图
1.2DNA提取及PCR扩增
DNA提取采用PowerSoil®DNAIsolationKit试剂盒，按照试剂盒流程提取DNA。以所提取各样品DNA为模版，对其16SrDNAV4区扩增。反应体系为30μL，上游引物为EUb341f：5′-cctacgggaggcagcag-3′，下游引物为Eub907r：5′-ccgtcaattcctttgagttt-3′。PCR扩增管中添加DNA模板0.5μL，正反向引物各0.6μL，灭菌水22.4μL，dNTP2.4μL，3μL缓冲液，ExTaq酶0.5μL。PCR反应程序：先94℃预变性10min，然后进行30个循环(94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。
扩增结束后，运用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，使用AxyprepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)切胶回收DNA。PCR扩增后的条带亮度明显，位置清晰，可直接用于后续测序分析。委托北京理化分析测试中心进行IlluminaMiSeq高通量测序。
1.3高通量测序数据分析
本研究采用IlluminaMiSeqPE2×125测序方法进行测序。测序数据下机后，根据Barcode拆分不同样本数据，并去除Barcode序列及引物序列，利用FastQC对序列进行质量控制。使用FLASH(v1.2.7，ccb.jhu.edu/software/FLASH/)根据overlap拼接Miseq双端测序数据，拼接成功率控制在90%以上。利用QIIME(1.8，qiime.org/)过滤低质量序列，利用UCLUST(v1.2.22，http://www.drive5.com/uclust/downloads1_2_22q.html)对获得的高质量序列进行操作分类单元(OTU)划分，97%作为相似性阈值，并将获得的OTU与SILVA(Realease123，www.arb-silva.de)非冗余度0.9的16S序列数据库比对，获得各OTU代表序列的分类信息。基于OTU的聚类结果，使用QIIME(1.8，qiime.org/)软件计算各个样本α多样性，以反映本次测序深度、物种均匀性等，并根据注释结果，计算样本间距离矩阵，进行PCA可视化。利用ANOVA(analysisofvariance)方法计算污水厂与反应器中门和纲水平上物种注释的丰度差异情况。利用冗余分析(RDA)解析微生物与环境因子的相关性。实验设计原始数据上传NCBI网站，数据项目编号(BioSampleaccession)为SAMN08107549。
1.4常规水质指标测定
废水中常规指标检测方法为：COD采用微波消解法;氨氮采用纳氏试剂分光光度法(HJ535-2009);硝态氮采用麝香草酚分光光度法(GB/T5750.5-2006);亚硝态氮利用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB/T7493-1987);污泥浓度(MLSS)利用恒重法;pH采用PHB-2型pH计;DO采用LDO™便携式溶氧仪。
1.5统计分析
所得微生物群落结构数据利用SPSS19.0软件进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2结果与讨论
2.1水质处理效果分析
对污水厂和实验室反应器AO工艺处理系统进行水质指标监测，分别共计142d和45d，其对氨氮和COD处理效果分别如图2和图3所示。
图2污水厂氨氮和COD去除效果
图3实验室反应器氨氮和COD处理效果
由图2可知，污水厂进水COD浓度为384~732mg˙L−1，最终出水COD浓度为24~145mg˙L−1，COD去除率为73.54%~96.52%，COD平均去除率为87.25%。污水厂进水氨氮浓度为256.0~491.0mg˙L−1，最终出水氨氮浓度为1.1~163.0mg˙L−1，氨氮去除率为64.15%~99.66%，氨氮平均去除率为89.57%。研究表明，淀粉工业废水含有大量含碳有机物、含氮有机物以及多种微量元素，易被微生物利用分解。本研究中，污水厂污泥浓度前期较低，在运行第3天取样，污泥浓度为2215mg˙L−1。为了提高污泥硝化能力，污水厂提高生化池水温，由29℃提高到34℃，同时延长污泥停留时间，到第132天所采样品Z1、Z2污泥浓度已达到3683mg˙L−1，COD和氨氮浓度去除效果逐渐提高。邓仁建等研究发现，提高污泥浓度有助于提高COD和总氮去除率，在污泥浓度为4300mg˙L−1时，SBR总磷去除率最高为75.6%。KAWASAKI等研究发现，污泥浓度较低时，有机物不能被完全降解;当污泥浓度维持在3000~5000mg˙L−1时，处理效果稳定。
由图3可知，实验室AO反应器进水COD浓度为315~478mg˙L−1，最终出水COD浓度为40~80mg˙L−1，COD去除率为78.57%~90.83%，COD平均去除率为84.22%。进水氨氮浓度为364~521mg˙L−1，最终出水氨氮浓度为49.9~434.7mg˙L−1，氨氮去除率为4.21%~88.50%，氨氮平均去除率为39.57%。反应器脱氮效率达到88.50%，认为反应器启动成功。COD去除效果变化不明显，前期污泥驯化阶段直到最后，COD去除率均在90%以上，甚至出现0mg˙L−1，证明该实验反应器进水可能存在碳源不足的情况，需外加碳源提高脱氮性能。前期(第1～10天)和中期(第11～35天)污泥驯化阶段处理效果较差，后期(第36～45天)处理效果逐渐好转，结果表明该淀粉工业污水处理厂的活性污泥对相同氨氮、COD浓度的淀粉工业废水及葡萄糖模拟废水均能达到较好的处理效果。钟振兴等通过接种实际污水厂好氧池污泥，以实验室反应器处理模拟废水时发现，COD和氨氮的去除率分别高达90.9%和90.4%，并基本保持稳定，这与本研究结果相一致。
2.2微生物群落多样性分析
为了进一步揭示AO工艺中污染物的去除途径，采用Illumina高通量测序对活性污泥样品中微生物菌群进行多样性分析。如表1所示，7个样品获得的有效OTU数在1087~1628个之间，好氧池OTU数目在污水厂及反应器中均呈现下降趋势，其原因可能是专属菌群相对含量逐渐提高。Chao1指数侧重于群落丰度，PDwholetree指数与Shannon指数侧重于群落的多样性，数值越大，群落多样性越高，菌群覆盖度指数(Goodscoverage指数)用来表示本次测序相对于整体样本的覆盖程度，数值越高，覆盖程度越高。
表1活性污泥中菌群多样性指数
由表1可知，在97%的相似水平上，Goodscoverage指数均在94%以上，说明本次测序结果可充分反应微生物真实情况。Chao1指数在实验室AO反应器的好氧段中整体高于污水厂，说明其物种丰富度较高，并且在各个样品中，随着水质好转，Chao1指数呈现降低趋势。而Shannon和Simpson指数在污水厂的好氧段中明显低于AO反应器，表明生物多样性在AO反应器中较高，且在污水厂中缺氧段丰富度和多样性高于好氧段。上述结果原因可能是各个生物系统体系运行条件有差异，尽管2系统均能对氨氮、COD达到很好的去除效率，但物种多样性及丰富度均存在差异，表明水质成分存在差异时，作用菌群差异较大。ZHANG等研究结果与本实验结果类似，利用CA解析15个不同进水及工艺的污水处理厂微生物群落结构，相对距离为0.6时，根据进水水质差异分为5组，进水水质差异是影响微生物多样性和丰富度的关键因素。具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。
2.3微生物群落多样性的主成分分析
根据主成分分析得到各样本OTU数据的因子载荷，其是污泥样品中微生物群落结构和功能的具体反映。图4为污水厂及AO反应器7个样品的微生物群落主成分分析图，反映了不同进水成分污泥样品的因子载荷变化，样本间空间距离较近，表明物种组成相对类似。如图4所示，横坐标PC1贡献度为66.3%，PC2贡献度为29.1%，PC3贡献度为2.5%，污水厂样品分布在一侧，离散程度较高，实验室AO反应器中W1、W2和W3微生物群落结构相似度较高。X1、X2距离相对于Z1和Z2较远,W2、W3距离相对于W1距离较近。综上分析，污水厂缺氧段好氧段中存在专属菌群，其差异大，水处理效果良好，郭小马等的研究结果与本研究结果类似，在COD和氨氮去除率分别达到81%和91%时，缺氧段与好氧段微生物种类无明显差异但相对数量差异明显。而实验室AO反应器反应体系较小，微生物群落结构差异相对较小。
图4微生物群落多样性的主成分分析
2.4微生物菌群结构分析
在门、纲和属水平上对测序结果进行归类，分析所取4个污水站污泥样品和3个反应器样品在不同分类水平上的菌群组成及相对丰度差异，结果见图5。
图5门水平下微生物群落相对丰度
由图5可见，在门级别，淀粉工业污水厂中各样品中(X1~Z2)共统计到51个菌门。Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Actinobacteria和Sacibacteria在各样本中为主要菌群，其在各阶段总丰度平均为86.87%，且总体差异较小。对应AO反应器中，Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes总相对丰度达到73.12%~75.61%，为各样本中绝对的优势菌群，这与MA等和高晨晨等考察焦化废水及9座不同污水处理厂，发现在处理不同进水及工艺存在差别时，主要优势菌门为Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Firmicutes，多样性不随水质工艺产生差异，但相对丰度有所不同，与本研究结论一致。各个阶段微生物丰度变化较为明显的为Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi等。污水厂中，好氧池各样品Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes相对丰度分别由23.78%、18.47%和17.81%增长为47.77%、26.36%和12.05%。而AO反应器中，Proteobacteria和Bacteroidetes分别由39.99%和6.62%增长为46.25%和21.93%。Chloroflexi在污水厂及反应器中分别由17.82%和21.48%降至12.04%和2.76%。康晓荣[26]研究发现，Proteobacteria和Bacteroidetes随着总氮和总磷去除率的提高，其丰度也相应增加，具有重要的硝化及反硝化除磷作用，而Firmicutes则与COD的去除有关。Chloroflexi优势在各生物系统中减弱，可能是因为Chloroflexi为严格厌氧细菌，进入好氧段后，溶解氧的增加抑制了其生长代谢，而Z1，Z2之间可能是因为Proteobacteria世代时间相对于Chloroflexi较短，在反应器营养充分的条件下实现了更多的增殖。
对各样品变形菌门微生物的分布特征进行分析，结果见表2。
由表2可知，所选4个样品中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria是变形菌门中最优势菌纲，并且呈一定增长趋势。HU等研究发现，Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria在脱氮过程中发挥了重要作用并与反应器氨氮浓度呈正相关。而在实验室AO反应器中，除去Betaproteobacteria呈递增趋势，Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria均呈现先增后减的波动趋势。根据YE等和王未青的研究，Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria参与硝酸盐的还原，其从属菌——聚糖菌又影响了生物除磷过程。在本次实验中，实验室AO反应器进水尽管保证了COD、氨氮等浓度一样，但其中氮磷组成形式、微量元素及其他有机质的差异仍然影响了微生物群落构成。
在本阶段所取的6个样品中，共检测出827种菌属，其相对丰度如图6所示。
图6属水平下微生物群落相对丰度
由图6可知，污水厂与实验室AO反应器各样品菌属组成相似。优势菌属为Anaerolineaceae、Saprospiraceae和Betaproteobacteria等，三者总丰度占到了30%，而Saprospiraceae在污水厂中由8.89%降至1.04%，在AO反应器中由1.68%增为11.75%。有研究表明，Saprospiraceae能够分泌胞外聚合物，代谢葡萄糖、半乳糖、醋酸盐等，因AO反应器反应体系较小，微生物群落均能获得足量葡萄糖、半乳糖等有机质，而污水厂X1、X2与Z1、Z2取样点距离较远，后期葡糖糖供给不足，致使Saprospiraceae大量较少。
以上2种污泥系统中AOB(Nitrosomonas，Nitrosospira)和NOB(Nitrospira，Nitrospina)种类完全一致，但相对丰度差异较大。AOB在污水厂和AO反应器中相对丰度分别为0.12%和0.07%，NOB分别为0.08%和0.21%。这可能是因为污水厂反应体系更为完整且缺氧池、好氧池等相对独立，专属菌群长势良好。MA等研究发现，活性污泥中AOB和NOB相对丰度处于0.01%~1%的条件下，污水厂仍能保持高效脱氮。有研究表明，活性污泥中与反硝化作用有关的主要菌属包括：Azoarcus、Thauera、Comamonas、Rhodobacter、Rhodocyclus和Dechloromonas等。在本研究中，也发现了Azoarcus、Thauera和Comamonas等可能参与反硝化作用的细菌类群，其相对丰度如表3所示。由表3可知，Comamonas为其中丰度最高菌群，且各菌属随水质变化成一定的演替规律。
表3各样品反硝化相关菌群相对丰度
2.52种工艺微生物构成差异
ANOVA(analysisofvariance)比较污水厂与实验室AO反应器在不同分类水平上物种丰度差异[34]，结果见表4。
如图7所示，在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)丰度在污水厂和反应器之间存在显著差异，其丰度在污水厂中显著高于反应器(P=0.002<0.01)，而变形菌门、拟杆菌门和绿弯菌门等无显著差异(P>0.05)。在纲水平上，变形菌门中的Betaproteobacteria相对丰度显著低于反应器(P=0.045<0.05)。厚壁菌门中的Bacilli、Negativicutes相对丰度污水厂显著高于反应器(P=0.031、0.032<0.05)、Ignavibacteria则显著高于反应器(P=0.004<0.01)。结合污水厂及实验室AO小试装置水质处理效果可知，菌群丰度的差异是进水水质成分差异造成，并且受水质处理效果影响。
表4污水厂与反应器门、纲水平上物种相对丰度的差异
本研究选取污泥浓度(MLSS)、COD、氨氮(ammonia)和温度(T)作为环境因子，结合各样本微生物群落结构，利用冗余分析(RDA)研究微生物与环境因子的相关性。结果(见图7)表明，主轴1和主轴2共解释了微生物群落结构与水质参数总变异的80.31%，污水厂样品中，X1、X2分布较近，与Z1、Z2相同，而实验室AO装置分布较远，水质处理较差的W1、W2分布较近，而W3距离较远。并且实验室装置前期受氨氮影响较大。X1、X2期间受COD影响较大，经调试污泥停留时间后，Z1、Z2污泥浓度增加。微生物群落中Corynebacterium和Saprospiraceae受COD影响较大，Comamonadaceae、Salmonella以及Variovorax受氨氮影响较大。Oxalobacteraceae及Lactobacillus与污泥浓度相关。
图7污水厂和反应器微生物RDA分析结果
3结论
1)进水COD、氨氮浓度分别为500、450mg˙L−1时，污水厂COD和氨氮出水浓度为83和1.3mg˙L−1,COD去除率为73.54%~96.52%，氨氮去除率为64.15%~99.66%。AO反应器出水浓度分别为78和107mg˙L−1，COD去除率为78.57%~90.83%，氨氮去除率为4.21%~88.50%。经过一定时间的调试污泥驯化后，工业污水厂活性污泥对人工配水保持较高的净化效率。
2)根据PCA分析，受反应体系影响，污水厂各样品微生物群落结构离散程度较大，而AO反应器由于体系小，水质相对稳定，3个污泥样品微生物群落结构差异相对较小。
3)高通量测序结果表明，变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、绿弯菌(Chloroflexi)、厚壁菌(Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)和Sacibacteria为污水厂和反应器中主要菌群，相对丰度为81.53%~92.36%。受水质成分影响，在污水厂系统和反应器中差异较为明显的为Firmicutes和Betaproteobacteria和Saprospiraceae等。
