屠宰废水中抗生素抗性基因在废水处理各工艺中去除与累积效果的研究

伴随着抗生素在养殖业和医疗业的大量使用，抗生素抗性基因(antibioticresistancegenes，ARGs)污染逐渐被人们重视。近年来我国浙江、上海、广东、河北等多个地区均有报道存在不同程度的抗生素抗性基因污染。尽管国内外对于抗生素抗性基因转移、去除开展了大量研究，但多局限于实验室内模拟阶段，工程实践方面报道较少，尤其对于抗生素抗性基因含量高于生活污水且低于养殖废水的屠宰废水，在污水处理工程中去除和累积情况未见报道。为此深入研究屠宰废水中抗生素抗性基因在污水处理各工艺中去除与累积效果，对于优化废水处理工艺和控制抗生素抗性基因污染具有重要现实意义。

本研究以2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)和3种四环素类抗性基因(tetA、tetB和tetC)为研究对象，研究了其在屠宰废水处理工程中各个环节的绝对含量和相对丰度变化情况，以期寻找到最佳的抗生素抗性基因处理工艺，为相关企事业单位优化设计污水处理工艺提供理论依据，为浙江省“五水共治”提供技术支持。

1材料与方法

1.1水样来源：水样样品来源于浙江中法农业科技发展有限公司屠宰废水处理工程，其工程按流程包括3000m3 厌氧沼气池、3600m3 潜流人工湿地、3600m3氧化塘和18hm2 表面流人工湿地等4个主要处理环节。按照废水处理流程选取了屠宰废水原水(即厌氧沼气池入水，采样点编号W1)、厌氧沼气池出水(即潜流人工湿地入水，采样点编号W2)、潜流人工湿地出水(即氧化塘入水，采样点编号W3)、氧化塘出水(即表面流人工湿地入水，采样点编号W4)、表面流人工湿地出水(即工程最终出水，采样点编号W5)等5个采样点，样品常温采集，保存于4℃环境，采样时间为2014年6月至2016年5月，每月下旬采样1次。

1.2实验试剂：TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffe、MgCl2、dNTP、DNAMarker、6×DNALoadingDye、10×TAE、土壤基因组DNA快速抽提试剂盒、溴化乙锭、柱式DNA胶回收试剂盒、一步法快速感受态细胞制备试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，以上均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。pMD 18-TVector，购于宝生物工程(大连)有限公司。引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3试验仪器：洁净工作台、稳压稳流电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、微型电泳槽、PCR反应扩增仪、紫外分光光度计、微量移液器、3730XL测序仪、LightCycler480SoftwareSetup。

1.4试验方法：

1.4.1DNA抽提:依照土壤基因组DNA快速抽提试剂盒说明书操作。

1. 4.2标准品制备:

1.4.2.1普通PCR:PCR反应体系25μL：模板DNA0.5μL，引物F(10μmol/L)0.5μL，引物R(10μmol/L)0.5μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，TaqBuffer(10×)2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，H2O18.3μL。反应条件为：预变性95℃ 3min;变性94℃30s，退火56℃ 30s，延伸72℃ 30s，修复延伸72℃ 8min，循环数35。

1.4.2.2：PCR电泳2% 琼脂糖凝胶，1×TAE，150V，100mA，20min电泳观察(图1)。

1.4.2.3PCR回收依照柱式DNA胶回收试剂盒说明操作。1.4.2.4克隆测序连接反应10μL：Solution5μL，pMD18-TVector10ng，PCRProduct5μL，4℃过夜连接。连接产物转化依照一步法快速感受态细胞制备试剂盒说明操作。质粒提取依照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明操作。

1.4.2.5定量质粒信息:构建好的质粒经测序鉴定无误后用紫外分光光度计测定质粒D260nm的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μL)。10倍梯度稀释构建好的各质粒，90μL稀释液+10μL质粒，做4～6个点，通过预试验选取合适标准品用于制备标准曲线。

1.4.3荧光定量PCR检测反应体系见表1，

PCR循环条件见表2。完成后，把加好样品的96/384 孔板放在LightCycler480SoftwareSetup(Roche)中进行反应。

2结果与分析

由表3可见，5种抗生素抗性基因sul1、sul2、txtA，txtB和txtC在屠宰场废水原水中均有检出，其平均绝对含量分别为5.18×105、1.48×105、6.71×105、5.77×103 和9.77×105copies/L，5种抗生素抗性基因中sul1、sul2、txtA和txtC平均绝对含量较高，说明含有sul1、sul2、txtA和txtC基因的宿主菌较含有txtB基因的宿主菌对各种环境耐受力更强。本次屠宰废水抗性基因平均绝对含量与之前报道的养殖废水中含量相当，说明屠宰废水和养殖废水一样是抗生素抗性基因主要污染源之一。

2.1厌氧处理对5种抗生素抗性基因的绝对含量和相对丰度的影响:从厌氧池进出水中可见，水质中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC5种抗生素抗性基因平均绝对含量均有所下降(图2、表3)，基于水量平衡计算可得5种抗生素抗性基因平均去除率分别为43.06%、28.35%、67.64%、31.65%和43.31%。但从5种抗生素抗性基因平均相对丰度分析(图3、表3)

，仅有txtA基因呈现下降趋势，sul1、sul2、txtB和txtC基因平均相对丰度呈现上升趋势，由此推断厌氧处理可以通过减少微生物生物量降低抗生素抗性基因绝对含量，且对txtA基因有一定的处理效果，但厌氧处理可能对于sul1、sul2、txtB和txtC基因存在潜在的累积风险。厌氧处理过程中水力停留时间(SRT)、温度、pH值等工艺参数是否对于抗生素抗性基因降解和吸附产生影响，以及如何改善厌氧处理工艺流程提高对于sul1、sul2、txtB和txtC的去除效率有待进一步研究

2.2潜流人工湿地对5种抗生素抗性基因的绝对含量和相对丰度的影响:从潜流人工湿地进出水中可见，水质中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC这5种抗生素抗性基因平均绝对含量均有所上升(图2、表3)。从基因平均相对丰度分析，sul2和txtA基因呈现下降趋势，txtB和txtC基因平均相对丰度没有明显变化，而sul1基因平均相对丰度呈现上升趋势(图3、表3)。

上述结果说明，被测污水工程中潜流人工湿地对于sul2和txtA基因有一定去除效果，对于sul1、txtB和txtC基因没有明显去除能力，但由于潜流人工湿地运行引起微生物生物量增加，使得抗生素抗性基因的绝对含量呈现上升趋势。一般研究报道认为潜流人工湿地可以有效降低抗生素抗性基因的绝对含量和相对含量，但结论大多来源于实验室模拟条件和工程实例中污水含抗生素抗性基因含量较高的情况，本次针对污水处理工程中潜流人工湿地对抗生素抗性基因检测结果显示，其处理效果并不理想，在污水处理工程中是否存在湿地使用时间及其他工艺运行参数影响潜流人工湿地对抗生素抗性基因去除效果有待进一步研究。

2.3氧化塘对5种抗生素抗性基因的绝对含量和相对丰度的影响:从氧化塘进出水中可见，水质中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC这5种抗生素抗性基因平均绝对含量均有所下降(图2、表3)，计算可得氧化塘对于5种抗生素抗性基因平均去除率分别为77.59%、18.34%、82.05%、98.55%和96.82%。但出水中仅txtB和txtC基因平均相对丰度呈现下降趋势，sul1、sul2和txtA这3种抗生素抗性基因平均相对丰度呈现上升趋势(图3、表3)。研究表明，氧化塘对于不同抗生素抗性基因相对丰度影响不一，joy等研究表明氧化塘可以有效降低ermB和ermF的丰度，而Barkovskii等研究认为氧化塘处理可以降低tetB和txtL基因的相对丰度，但对tetG、tetM、tetO和txtX基因的相对丰度没有影响甚至有所提高，究其原因可能是这些基因常位于转移元件上，在处理过程中发生了基因的水平转移。本次检测结果说明，氧化塘可以通过减少微生物生物量降低抗生素抗性基因绝对含量，氧化塘工艺对于txtB和txtC基因去除效果较好，而对于sul1、sul2和txtA基因可能存在累积风险。

2.4表面流人工湿地对5种抗生素抗性基因的绝对含量和相对丰度的影响:从表面流人工湿地进出水中可见，水质中sul1、sul2、txtA和txtC这4种抗生素抗性基因的平均绝对含量和平均相对丰度均呈现下降趋势，4种抗生素抗性基因平均去除率分别为99.23%、98.79%、97.86%和99.63%，但txtB基因的平均绝对含量和平均相对丰度均未发生明显变化(图2、图3、表3)。一般认为表面流人工湿地可以通过吸附、过滤、氧化、沉淀、微生物分解、转化、植物遮蔽等作用机理除去抗性基因，本次检测结果证明了上述观点，但本次检测结果也表明表面流人工湿地对于绝对含量相对较低的txtB基因去除效果不佳，由于txtB基因在屠宰废水中含量不高，因此屠宰废水处理工程实例中可以采用表面流人工湿地作为有效降低抗生素抗性基因含量的工艺流程。

3结论与讨论

从本次研究结果分析，目前，浙江中法农业科技发展有限公司屠宰废水处理工程可以有效去除大部分抗生素抗性基因，工程中不同的处理流程对于不同的抗生素抗性基因处理效果不同，厌氧处理工艺和氧化塘工艺可以通过减少微生物生物量有效地降低抗生素抗性基因的绝对含量，但可能存在某些抗生素抗性基因累积风险，而表面流人工湿地对于屠宰废水中抗生素抗性基因的绝对含量和相对丰度有有效的处理效果。研究表明，在传统生物污水处理工艺基础上增加消毒工艺、高级氧化工艺等深度处理工艺可以更有效地消减抗生素抗性基因含量，为此建议企业在现有基础上增加深度处理工艺。

目前，我国对于污水中抗生素抗性基因排放并无要求，但考虑到抗生素抗性基因对人类带来的风险，建议在经济条件允许的条件下，企业尽量选择对于抗生素抗性基因处理效果好的污水处理工艺，以便应对抗生素抗性基因污染。同时，国家相关部门应尽快制定养殖业中合理使用抗生素的标准并出台抗生素及抗生素抗性基因污染治理的政策和法规，以便规范养殖业健康良性发展并改善我国现阶段污染状况。鉴于污水工程是抗生素抗性基因转移和传递的重要污染源，建议未来关于抗生素抗性基因研究重点放在：(1)抗生素抗性基因环境传播机制;(2)污水处理过程中抗生素浓度、重金属含量及微生物群落与抗生素抗性基因的关系;(3)污水处理工艺参数对抗生素抗性基因去除和累积的影响。嘉兴市是国家首批海绵城市建设试点城市，建议地方各级有关部门提高对抗生素抗性基因污染治理的重视程度，加大对于抗生素抗性基因治理应用性研究成果的推广力度，以便实现海绵城市对污染物削减率目标，更好地为浙江省“五水共治”提供经验和技术支持。

原标题：屠宰废水中抗生素抗性基因在废水处理各工艺中去除与累积效果的研究