色谱柱是高效液相色谱的核心部件。它主要起到了分离作用。色谱柱同样也是一个消耗品,在流动相冲刷的过程和样品在分析的过程,填料损失和污染使得色谱柱的性能慢慢下降。所以,对于高效液相色谱尤其是常用的C18柱,需要在一定时间内对其性能做一个评估,同样,新的色谱柱也要对色谱柱做一个有效的体检

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你的高效液相色谱柱“任性”吗?

2015-10-15 09:35 来源: 仪器信息网微信

色谱柱是高效液相色谱的核心部件。它主要起到了分离作用。色谱柱同样也是一个消耗品,在流动相冲刷的过程和样品在分析的过程,填料损失和污染使得色谱柱的性能慢慢下降。所以,对于高效液相色谱尤其是常用的C18柱,需要在一定时间内对其性能做一个评估,同样,新的色谱柱也要对色谱柱做一个有效的体检。这个体检就是评估色谱柱的性能。

在讲评估色谱柱性能之前,青青草老师讲一段自己的经历。

曾经在07年我在一家仪器公司从事装色谱柱工作,是商品柱哦。主要是3微米,5微米,10微米C18分析柱子,其中前两个颗粒大小的色谱柱是分析型色谱柱。反相色谱柱最一般的规格型号是4.6mm内径,150mm,250mm长度,颗粒度一般有3微米,5微米,其中5微米比较多。当然还有其他规格长度的色谱柱,这里就不再展开讲述了。色谱柱主要是两端封有筛板柱头,中间的空心不锈钢管子中装有填料。这些填料主要作用就是吸附样品,同样,在流动相推动下,混合样品中各物质由于结构性质不同,从而使得他们被吸附脱附的能力不同,被分离。

高效液相色谱柱,尤其是C18的反相色谱柱是通过高压匀浆的方法装填的。

通过匀浆液使得色谱填料均匀悬浮在匀浆管中,匀浆管下面装有一根空的色谱管,这根色谱管底部用柱头和筛板固定,通过泵的瞬间高压,流动相将色谱填料填压入色谱管,稳定片刻后,另一头装上筛板和柱头,即可。由于装填色谱柱受到很多的因素影响,所以,不是每一根色谱柱都是能够装填好的,所以,新的色谱柱要通过测试其性能,其性能符合要求,才能够销售。

而我们客户呢,对于购置的新色谱柱,首先需要测试其性能,包括有效塔板数,拖尾因子。这个是最重要的指标。如果这些指标符合要求,那么这根色谱柱是OK的。大家知道,有些小公司没有HPLC,他们销售的色谱柱有可能是不好的,所以,对新色谱柱建立性能档案是很有必要。如果不合格的新色谱柱,立即向供应商调换,才能够保证你的权益。

那么如何测试色谱柱性能呢?

这里qingqingcao老师给出两个基本的公式。有效塔板数,拖尾因子。

1.有效板数塔

在我们学习色谱理论时候,我们讲过理论塔板数,有效塔板数。这里我不再讲述公式如何来的。我们这里打个比方,现在我手头有两个同样长度,同样内径,同样填料,填料的颗粒度相同的C18色谱柱,一根装的紧,一根装的松,那么大家认为你会选哪根?答案是必然的,当然首选紧的那根。原因是装的紧的那根色谱柱,单位体积内填料多,填料多那么分离效果就好,而松的那根,单位体积填料少,那么分离效果就显得差。那么如何判断相同规格型号长度的色谱柱填料填的多寡,那么就需要用到有效塔板数了。也就是说,通过相同条件下测试同一物质,有效塔板数多的那根色谱性能高,填料填的多,反之就是不好的那根。

我们首先给出公式:

其中,to是死时间,也就是物质不被保留,在色谱系统中走过的时间。一般可以认为进样冲击是死时间。或者剪一根和色谱柱相同长度的空管,装在色谱柱位置,以纯水为流动相,相同流速,进甲醇,以254nm为检测波长,出来峰的那个时间一般认为是死时间。这个方法确实比较粗糙,但是管用。

我们看下公式,相同浓度同一物质,相同色谱条件下,如果半峰宽一致的情况下,某物质被保留的时间越长,则有效塔板数越多。试想,色谱柱越长,填料相同内径相同,装填效果相同的条件下,长的色谱柱必定性能好。

同样,色谱样品条件相同的情况下,半峰宽越窄,色谱柱越好。也就是说,填料装的越紧越好。

其中tm-t0是调整保留时间。W1/2h是半峰宽。

对于C18柱测试有效塔板数,我们规定使用5mg/ml萘,作为测试品,以甲醇:纯水=70:30(v/v),检测波长为254nm,流速1.0ml/min。有了这些条件,我们再测试下死时间(上述空管+甲醇测死时间),我们就可以计算有效塔板数了。

对于W1/2h如何测试,一般的色谱工作站都会给出每个色谱峰的半峰宽,我们找抄即可。

这里给出一个例题,测试色谱柱的有效塔板数(Neff)

用测试萘的色谱条件测试色谱柱的有效塔板数,有四根色谱柱,

我们可以看到,同样长度的色谱柱,颗粒度越小,其有效塔板数越多。这个如何理解呢?颗粒度越小,那么填料在单位体积内的数量越多,保留效率越高,所以,保留时间比颗粒度小的同样规格的色谱柱要长,这也说明,如果长度,填料内径相同的条件下,其分离效果越高。

相同填料粒径和内径的色谱柱,如果长度越长,填料一般来说越多,保留时间长证明了其保留能力强,这样体现在色谱柱有效塔板数比相同规格的略短的色谱柱多。

有时候使用相同的色谱柱,在用了一段时间后,相同浓度的相同条件下,色谱峰变宽,微观角度来解释,就是色谱柱填料流失。使得色谱柱中填料数目减少,使得色谱柱颗粒间间隙宽。物质在色谱柱里走的路径多了,所以色谱柱展宽。这样子就证明色谱柱性能下降。如果色谱柱性能降到不能有效分离物质,那么这根色谱柱寿终正寝了。

对于C18柱,一般是用甲苯,联苯,萘等物质配成混合物,以5mg/ml萘计算有效塔板数。色谱柱一般需要3个月或半年测定一次有效塔板数。现在色谱工作站有计算有效塔板数的功能,一般我们只要填入t0死时间,就可以计算色谱柱的有效塔板数了。在15年前或者更在,色谱工作者们是通过三角尺和色谱图量的方法计算有效塔板数的。当时确实条件艰苦,但是这样操作,能够实时看到色谱柱使用过程中“牺牲”自我的一个历程。

2.拖尾因子(tailingfactor)

对于拖尾因子,根据中国药典,拖尾因子是指:

从图中,我们可以看到,W0.05h指5%峰高处的峰宽,以峰顶点做垂线到5%峰宽,分为两份,其中前一份为d1,假如前半峰d1=后半峰,则拖尾因子为1.00.也就是前后半峰5%处宽度相等,说明峰对称。如果前半峰d1小于后半峰,则Tailingfactor大于1,则峰后拖尾,反之是前拖。

如果排除溶剂因素和物质吸附或键合相尾部效应等因素,单纯从色谱柱填充效果来看,如果色谱柱前面填的紧密,后面填的疏松,即便有效塔板数合格,那么峰显示处后拖尾;如果色谱柱前面填得疏松,后面紧密,则峰显示前拖。所以,中国药典要求色谱柱拖尾因子要在【0.95,1.05】之间。

有许多朋友会讲,还有对称因子。因为在我国一般用拖尾因子即可,对称因子及10%峰高处峰宽比较对称性,只是不同国家定义不同要求不同而已,具体可以参考一些书籍,这里不展开叙述了。在色谱工作站,也有拖尾因子计算,我们选择5%处峰高处计算即可。

对于色谱柱需要给它做一个有效的体检卡,一般在体检卡上检测有效塔板数和拖尾因子即可,相关的方法,即上述叙述。

对于C18色谱柱清洗,一般的步骤是:洗去缓冲盐用不含盐的流动相冲洗,把缓冲盐洗涤干净,一般是20倍柱体积,也就是0.8-1.0ml/min洗涤各1.5-2小时,然后用乙腈或甲醇洗涤,20倍柱体积,也就是0.8-1.0ml/min洗涤2小时。两端用螺母封柱。一般我比较喜欢用乙腈保存。虽然乙腈毒性是大,但是,乙腈粘度小。

如果色谱柱真的不能用,我们还可以卸下柱前端的柱头,把筛板用异丙醇超声波超洗,挖去前段被污染的色谱填料,补上新的色谱填料,这样,色谱柱暂时还可以用一段时间。

原标题:你的高效液相色谱柱“任性”吗?

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