摘要：芽孢杆菌(Bacillus)因生长快、表面积大、抗逆性强等优点在重金属污染土壤修复方面表现出了广阔的应用前景。对近年来报道的具有重金属污染土壤修复功能的芽孢杆菌种类进行了总结，梳理了其作用机制，并对其处理重金属污染的分子生物学机理进行了分析归纳，结果显示，已有20种以上芽孢杆菌表现出了重金属污染土壤修复功能，主要修复机制有生物溶解与沉淀、生物吸附与富集以及生物转化作用3种。最后对芽孢杆菌修复重金属污染土壤的前景进行了展望，以期为后续研究提供思路与参考。
关键词芽孢杆菌 铅镉污染 修复 抗性基因 基因组学
近年来，随着我国经济及工业化的快速发展，工矿企业、农业及生活等方面排放的重金属污染物逐渐增加，土壤重金属污染已经成为制约我国工农业可持续发展的重要因素[1]。2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，Cd、Ni、As、Cu、Pb、Hg、Cr、Zn点位超标率合计达到了21.7%[2]。
土壤中重金属的累积会影响营养元素的存在状态，导致土壤质量及生产力下降，重金属被植物吸收后，对植物的形态结构、生理代谢、信号传导及遗传等方面都会产生毒害作用，严重影响植物的生长发育。重金属污染最终的后果是影响人类健康，食用、吸入或者暴露于重金属污染环境，都将对人体的健康造成直接或间接影响[3]。对重金属污染环境进行有效治理，对于提高土壤生产力，改善生态环境，保护食品安全，保障人体健康，具有重要的现实意义[4]。微生物修复技术与传统的理化修复技术相比，具有经济有效、环境友好、绿色生态等优点，受到了国内外学者的广泛关注，已成为重金属污染土壤修复领域的热点。
芽孢杆菌(Bacillus)是一类广泛存在于耕地、林地、草地等生态环境的微生物，他们对外界有害因子抵抗力强，能够与陆生植物根系形成共生关系，是一种重要的农业促生菌[5]。目前关于芽孢杆菌在重金属污染治理方面的应用越来越多，其在重金属污染土壤修复中的作用也越来越得到认可[6]。本研究对重金属污染土壤芽孢杆菌修复技术进行了分析与总结，并尝试从基因水平探讨芽孢杆菌对重金属的作用机制，再对重金属污染土壤修复技术进行了展望，以期让芽孢杆菌在我国重金属污染土壤修复中发挥更大的作用。
1 具有重金属污染土壤修复功能的芽孢杆菌种类
芽孢杆菌因生长快、表面积大、对环境要求低、抗逆性强等优势，已在重金属污染治理中得到了广泛的应用。表1罗列了近年来对重金属污染土壤具有修复能力的芽孢杆菌[7-22]，研究较多的有枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌。
表1 具有重金属污染土壤修复能力的芽孢杆菌
Table 1Bacilluscapable of heavy metal contaminated soil remediation
2 芽孢杆菌修复重金属污染土壤的机理
2.1 生物溶解与沉淀
在重金属胁迫的条件下，芽孢杆菌可以产生大量的胞外分泌物，如有机酸、蛋白质、多肽、脂类等，这些分泌物可以提供大量的阴离子基团与重金属通过络合、螯合等多种方式结合形成沉淀物，降低重金属的生物毒性[23-24]。SARANYA等[25]将枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌分泌的脂蛋白类生物表面活性剂用于含铬废水的处理，结果显示在阳离子生物表面活性剂浓度最佳时，通过配位键合作用，水溶液中Cr(Ⅲ)的最大去除率达到了98%。HAN等[26]从Cd和Pb污染农田白菜根际土壤中分离到重金属固定化细菌——巨大芽孢杆菌N3，N3可以产生尿素酶、脱落酸和吲哚-3-乙酸，通过胞外吸附和生物沉淀以及提高土壤溶液pH来降低Cd和Pb的毒性，其对白菜叶片Cd和Pb的去除率可分别达到79.7%与83.5%。KHAN等[27]发现枯草芽孢杆菌可以利用铁载体的金属螯合特性来降低环境中Cd(Ⅱ)的含量，在铁载体存在下，其对Cd(Ⅱ)的胞内积累提高了5.22倍。BELOGOLOVA等[28]在研究根际细菌作用下，含铅化合物在植物体内的迁移转化及其在植物体内的积累时发现，在接种固氮菌和根际芽孢杆菌的土壤中，Pb的迁移增加；根及根际土壤中的Pb与铁氢化物螯合，使植物地上部分对Pb的吸收减少。
2.2 生物吸附与富集
生物吸附与富集通过细胞表面的官能团、聚合物等对重金属吸附后，由细胞的转运系统将重金属运送入细胞，被细胞代谢物吸附、固定形成重金属累积效应。芽孢杆菌胞外聚合物中含有大量的氨基、巯基、羟基、羧基、磷酸基和酰胺基等活性基团，这些基团与重金属离子结合，从而使环境中的重金属离子被吸附[29]。CHEN等[30]研究蜡样芽孢杆菌12-2对Pb(Ⅱ)吸附时发现，静电吸附是主要驱动力，而细菌的羧基、酰胺基和磷酸基为固定Pb(Ⅱ)提供了结合位点。通过静电吸附、离子交换和功能基团螯合作用的协同作用，Pb(Ⅱ)快速吸附在蜡样芽孢杆菌12-2上。SUN等[31]利用地衣芽孢杆菌研究了生物吸附剂对Ag(Ⅰ)的吸附作用，在优化条件下，Ag(Ⅰ)的生物吸附量和吸附率分别达到73.6 mg/g和73.6%，傅立叶变换红外光谱(FTIR)结果表明，在地衣芽孢杆菌中，酰胺基和羧基是与Ag(Ⅰ)结合的主要活性基团。OVES等[32]以苏云金芽孢杆菌为研究对象，研究了Cd、Cr、Cu、Pb、Ni等重金属的生物吸附，菌株对Ni、Cu、Cd都表现出了较好的吸附效果(吸附率分别为94.0%、91.8%和87.0%)；FTIR分析显示氨基、羧基、羟基和羰基参与了重金属的生物吸附。NAIK等[33]利用蜡样芽孢杆菌对电镀废水中的Cr(Ⅵ)进行了脱毒研究，电感耦合等离子体原子发射光谱和原子吸收光谱测定结果显示，该菌对75%以上的Cr(Ⅵ)有去除作用；用FTIR研究了该菌细胞表面官能团的构象变化，发现羧基、磷酸基、酰胺基等官能团是Cr(Ⅵ)的吸收和解毒过程中的重要组成部分。
2.3 生物转化作用
生物转化作用是指细胞通过氧化还原、甲基化和去甲基化以及生物矿化等作用改变重金属离子的溶解性、迁移性以及毒性，将高毒态转化为无毒态或低毒态，从而实现对重金属解毒的过程。重金属价态是决定其毒性的重要因素，芽孢杆菌对重金属元素的氧化还原是其重要的解毒机制之一，如蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及巨大芽孢杆菌可以通过自身分泌的酶改变重金属存在的价态，使高毒性的Cr(Ⅵ)还原为低毒性的Cr(Ⅲ)，从而降低Cr的毒性[34]。芽孢杆菌对重金属的生物矿化作用可降低其生物有效性和迁移能力，如芽孢杆菌KK1能将高毒性的Pb(NO3)2转化为溶解性较差的PbS以及在常态下无毒的PbCO3或PbSiO3，将Pb的有效性降低36%[35]。ABDEL MONEM等[36]研究了枯草芽孢杆菌117S对Ni的去除作用，该菌株对Ni的最大吸收量为351.6 μg/mL，进行细胞羧基酯化、细胞氨基甲基化、丙酮抽提菌体脂类或苯抽提菌体脂类处理后，该菌株对Ni的生物去除能力显著降低了22.0%～64.9%。
3 芽孢杆菌修复重金属污染土壤的分子生物学研 究进展
3.1 重金属抗性相关基因
细菌对重金属的抗性是一个复杂的过程，其作用机制主要是由许多基因在遗传水平上决定的。随着基因组学和相关分子生物学的发展，近年来许多与重金属抗性相关的基因也得以鉴定与分离，比如，抗汞基因merA、merE，抗铜基因pcoA、pcoR、cusABC，抗铬基因A、B，抗铅基因pbrA、pbrD，抗镍基因nikA、ncrA等。这些基因从作用机理角度又可分为分别参与Zn/Co/Cr、Zn/Co/Cd、Mn、Ni、Hg和Cu转运的基因czcABC、mdrL、mncA、nikR/ncrA、merE和copAB/cusABC/pcoR，分别参与Cd、Cu、Ni和Pb生物吸附的基因cadBD、cusF、nikA和pbrD，分别参与Hg、As和Cu氧化还原的基因merA、arsB和pcoA等[37-39]。这些基因的分离与鉴定极大地加速了重金属抗性菌株的筛选与基因工程菌的构建。比如，HUANG等[40]研究使用rhd和A作为PAHs降解和Cr(Ⅵ)抗性的基因标记，从10 284株菌株中筛选到1 195株能够同时降解有机污染物和抵抗重金属污染的细菌，其中芽孢杆菌是主要的微生物菌群。AMIN等[41]将抗汞基因merE克隆到pHLV载体中，构建表达重组质粒pHLMerE，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)C43(DE3)细胞进行过表达，获得了MerE蛋白。
3.2 基因组学在芽孢杆菌修复重金属污染土壤研究中的应用
近年来，随着现代分子生物学和生物信息学的迅猛发展，对微生物修复的研究也从微生物生理适应现象的宏观层面发展到内在机制的微观分子层面。尤其是高通量测序技术的飞速发展，大量芽孢杆菌基因组测序完成，到目前为止，在Genenbank(/genome/?term=Bacillus)公布基因组的芽孢杆菌已达260株以上，可获得的组装数据达9 900条以上，这些海量的基因组数据提供了大量芽孢杆菌遗传信息资源，为发掘重金属抗性新基因及探究抗性机理提供了许多线索和启示。CABALLERO等[42]对蜡样芽孢杆菌CITVM-11.1进行了全基因组测序并进行了基因功能的预测，在该基因组中发现了3个抗砷基因，2个抗铜基因，3个钴-锌-镉抗性基因，1个抗汞基因，1个抗铝基因，4个抗碲基因。LI等[43]应用基因组序列分析和比较基因组分析方法，研究了芽孢杆菌S3的抗性机制和进化关系，通过分析发现了30种以上重金属抗性相关基因，利用基因aioB、arsB和arsC为探针，探讨了芽孢杆菌S3中抗锑基因的起源和进化，揭示了芽孢杆菌属之间的进化关系和水平基因转移(HGT)事件。嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)SK3-4是一株耐铝嗜热细菌，LIM等[44]对其转录组进行测序发现，诱导条件下，有708个基因差异表达(倍数变化>2.00)，其中316个基因被上调，而347个基因被下调，为该菌耐铝分子机制阐述提供了重要的研究数据。
4 展 望
重金属污染土壤修复技术在实际应用上还存在很多局限，要达到经济与效率的统一也需要长久努力。今后的发展可以从以下几个方面入手：
(1) 针对重金属污染的特点，继续开展生长迅速、起效快、耐受性强的高效菌株的筛选与驯化，持续扩展高效菌株的来源，不断挖掘可协同修复的细菌、真菌进行优化组合，提高重金属污染土壤修复效率。
(2) 继续探索适合与芽孢杆菌联合修复的其他生物类群，尤其是生长迅速、生物量大、耐受性强的重金属富集植物。芽孢杆菌-植物联合修复技术集合了芽孢杆菌修复与植物修复两者的优点。一方面，植物在生长过程中会向土壤分泌有机物，土壤根际微生物获得来自植物的营养，种类更加丰富，代谢更加旺盛。另一方面，芽孢杆菌作为一种重要的促生菌，分解这类分泌物可产生有益的代谢产物，改变重金属存在状态，降低重金属的植物毒性，促进植物对营养元素的吸收，从而增强植物宿主对重金属的耐受性，促进植物的生长。
(3) 结合现代分子生物学与大数据分析技术，从分子领域深度研究芽孢杆菌修复机理，为实际工程应用提供理论支持。近年来高通量测序技术与基因组学兴起，越来越多的芽孢杆菌全基因组测序完成，各种重金属胁迫下基因表达组图谱信息公布，都为微观分子水平研究芽孢杆菌修复重金属污染土壤提供了许多信息，科研人员应从各种组学的海量数据中发掘、整理和获得有效信息，为基因工程菌株的构建或利用基因工程、合成生物学技术培育优良菌株提供理论支持。此外，基因组学等为重金属污染土壤修复研究提供了大量信息资源，为筛选重金属抗性菌株提供了大量的选择标记，研究人员应该以此为契机，探索开发高效率、高通量的抗性菌株筛选新技术。
