山东：水质磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定液相色谱-三重四极杆质谱法征求意见稿

2018-05-31 11:49 来源: 北极星环保网

北极星环保网获悉：日前，山东省环保厅发布水质磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定液相色谱-三重四极杆质谱法征求意见稿：

前言

本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准附录A为规范性附录，附录B、附录C、附录D、附录E为资料性附录。

本标准由山东省环保标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省环境监测中心站。

本标准验证单位：济南市环境监测中心站、泰安市环境保护监测站、山东省分析测试中心、山东省产品质量检验研究院、青岛谱尼测试有限公司、青岛市华测检测技术有限公司。

本标准主要起草人：郭文建、张慧、朱晨、王桂勋、岳太星、李红莉、丁波涛。

本标准为首次发布。

本标准由山东省环境保护厅提出并负责解释。

水质磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的测定

液相色谱-三重四极杆质谱法

警告：实验中使用的溶剂和试剂均具有一定的毒性，对健康具有潜在的危害，应尽量避免与这些化学品的直接接触。样品制备过程应在通风橱中进行，操作时应按规定要求佩戴防护器具;所用试剂及分析后的样品需回收并进行安全处理。

1 适用范围

本标准规定了测定水中12种磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素的液相色谱-三重四级杆质谱法。

本标准适用于地表水、地下水和废水中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶;诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氟罗沙星;脱水红霉素、罗红霉素、螺旋霉素的定性和定量检测。

当富集水样体积为500 ml，浓缩后定容体积为1.0 ml，进样体积为20 μl时，固相萃取的方法检出限范围为0.7 ng/L～6.9 ng/L，测定下限范围为2.8 ng/L～27.6 ng/L，详见附录A。

2 规范性引用文件

本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。

HJ/T91 地表水和污水监测技术规范

HJ/T164 地下水环境监测技术规范

3 方法原理

水样调节pH为2.0～4.0左右，经滤膜过滤除去颗粒物，水样中的抗生素类化合物经固相萃取柱富集净化，采用液相色谱-三重四极杆质谱法分离检测。采用电喷雾正离子模式电离，多反应监测(MRM)方式，根据目标化合物的保留时间和特征离子峰定性，内标法定量。

4 干扰与消除

在本方法规定的条件下，为防止金属离子与抗生素结合形成络合物，干扰固相萃取过程，降低此类化合物的提取效率。可向水样中加入乙二胺四乙酸四钠，抑制金属离子的干扰。水中余氯等其他具有氧化性的有机物会干扰磺胺类抗生素的测定，可向水中(按0.5L计)加入150 mg抗坏血酸去除干扰。

5 试剂和材料

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的不含目标化合物的纯水。

5.1 盐酸： (HCl)=1.189 g/ml，分析纯。

5.2 硫酸： (H2SO4)=1.84 g/m，分析纯。

5.3 乙腈(CH3CN)，色谱纯。

5.4 甲醇(CH3OH)，色谱纯。

5.5 甲酸 (HCOOH)：色谱纯。

5.6 乙二胺四乙酸四钠(Na4EDTA)，分析纯。

5.7 抗坏血酸(C6H8O6)。

5.8 盐酸溶液：量取50ml盐酸(5.1)，缓慢加入到纯水中，待温度降至室温后，用纯水定容到100 ml。

5.9 硫酸溶液：c(H2SO4)=4.0 mol/L。量取22 ml硫酸(5.2)，缓慢加入到纯水中，待温度降至室温后，用纯水定容到100 ml。

5.10 pH=2.0去离子水：用盐酸(5.8)溶液调节去离子水至pH=2.0。

5.11 0.1%甲酸去离子水溶液：量取0.5 ml甲酸(5.5)，缓慢加入到纯水中，待温度降至室温后，用纯水定容到500 ml。

5.12 甲醇/乙腈混合溶液：1+1。

5.13 0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液：量取0.5 ml甲酸(5.5)，缓慢加入到甲醇/乙腈混合溶液(5.12)中，用甲醇/乙腈混合溶液定容到500 ml。

5.14 稀释溶剂：0.1%的甲酸去离子水溶液(5.11)/0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液(5.13)，3+1。

5.15 抗生素标准贮备液：ρ=100 mg/L(参考浓度)

可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质(纯度≥95%)制备。贮备液在0℃-4℃避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。

使用标准物质制备标准贮备液的参考方法：准确称取10.0 mg抗生素类化合物标准物质，溶于100 ml甲醇(5.4)中，最终浓度为100 mg/L。

脱水红霉素可直接购买标准物质(纯度≥95%)或者由红霉素制备，推荐的制备方法为：量取400 μl 100 mg/L红霉素贮备液于20 ml棕色瓶中，加入19.6 ml甲醇(5.4)，然后加入约10 μl硫酸溶液(5.9)调pH至酸性，室温静置4 h后完成转化过程，可于-10℃以下避光保存2个月。

5.16 抗生素类化合物标准使用液：ρ=1.0 μg/ml(参考浓度)

将12种抗生素类化合物标准贮备液(5.15)按需要用甲醇(5.4)稀释。标准使用液于-10摄氏度以下避光保存，保质期2个月。使用时应恢复至室温，并摇匀。

5.17 内标贮备液：ρ=200 μg/ml(参考浓度)

内标物为13C3 Atrazine(阿特拉津)。内标可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质(纯度≥99%)制备。贮备液应在-10℃以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。

5.18 替代物贮备液：ρ=200 μg/ml(参考浓度)

喹诺酮类回收率替代物为环丙沙星-d8、磺胺类回收率替代物为磺胺二甲氧嘧啶-d6、大环内酯类替代物为脱水红霉素-d6。替代物可直接购买有证标准溶液，也可用标准物质(纯度≥95%)制备。贮备液应在-10℃以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。

5.19 内标使用液：2.0 μg/ml(参考浓度)

将内标贮备液(5.17)按需要用甲醇(5.4)稀释。内标使用液于冷冻保存，保质期1个月。使用时应恢复至室温，并摇匀。

5.20 替代物使用液：2.0 μg/ml(参考浓度)

将替代物贮备液(5.18)按需要用甲醇(5.4)稀释。替代物使用液于冷冻保存，保质期1个月。使用时应恢复至室温，并摇匀。

5.21 固相萃取柱：填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物(HLB)或同等柱效的萃取柱，规格为6 ml/500 mg。

5.22 滤膜：0.7 µm玻璃纤维或其他材质等效滤膜。

5.23 滤膜：0.22 µm聚四氟乙烯或其它等效滤膜。

5.24 氮气：纯度≥99.99%。

6 仪器和设备

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的A级玻璃器皿。

6.1 固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。

6.2 浓缩装置：自动氮吹浓缩仪或K-D浓缩器等性能相当的设备。

6.3 液相色谱/串联质谱仪：配有电喷雾离子化源(ESI)。

6.4 色谱柱：C18或等效反相高效液相色谱柱，参考规格为：50 mm(长度)×4.6mm(内径)，1.8 µm(填料内径)。

6.5 样品瓶：1000 ml带聚四氟乙烯内衬垫瓶盖的棕色玻璃瓶。

6.6 微量注射器：10 μl、20 μl、50 μl、100 μl、250 μl。

6.7 一般实验室常用仪器和设备。

7 样品

7.1 样品的采集

参照HJ/T91和HJ/T164的相关规定采集样品。

用预先洗涤干净并干燥的磨口棕色玻璃瓶采集水样，样品采集时应充满样品瓶(6.5)，不留空隙。

7.2 样品保存

水样于现场立即添加盐酸溶液(5.8)调节样品pH为2.0～4.0左右，并加入150 mg抗坏血酸(5.7)及0.25 g EDTA(5.6)，在0℃~4℃冷藏避光保存，7天内分析完毕。

7.3 试样制备

7.3.1 样品预处理

样品采用固相萃取法富集前，水样采用孔径为0.7 μm的玻璃纤维膜(5.22)过滤。

7.3.2 固相萃取法

分别用5 ml 甲醇(5.4)、5 ml去离子水、5 ml pH=2.0去离子水(5.10)活化固相萃取柱(5.21)，保证小柱柱头浸润。量取500 ml水样，加入25.0 μl替代物使用液(5.20)，采用盐酸溶液(5.8)调节水样pH为2.0～4.0左右，水样以10~15 ml/min的流速通过小柱。用去离子水淋洗小柱，去除小柱上的EDTA。之后用氮气(5.24)吹扫、干燥小柱。再用10 ml甲醇(5.4)以5 ml/min的流速洗脱小柱，洗脱液接收于收集管中。洗脱液经氮吹(5.24，注意保持液面微微波动)浓缩至0.5 ml左右，加入内标使用液(5.19)25 μl，用稀释溶剂(5.14)定容到1.0 ml，过0.22 μm有机滤膜后待测。

7.4 空白试样制备

7.4.1 以实验用水代替样品，按照水样处理(7.3)相同操作步骤，制备固相萃取法空白试样。

8 分析步骤

8.1 仪器参考条件

8.1.1 液相色谱参考条件

流动相：0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液(5.13，A相)，0.1%甲酸去离子水溶液(5.11，B相)。梯度洗脱程序见附录B。

流速：0.3 ml/min。

柱温：40 ℃。

进样体积：20 μl。

8.1.2 质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式。

毛细管电压：4000 V，干燥气体温度：350℃，雾化器压力：35 psi

干燥气体流速：10 L/min。

多离子反应监测方式(MRM)，具体条件参见附录C。对于不同质谱仪器，参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。

8.1.3 仪器调谐

按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对液相色谱/串联质谱仪进行仪器质量轴和分辨率调谐校正，以确保仪器处于最佳测试状态。

在仪器使用过程中，如发现仪器质量数出现明显偏差或灵敏度大幅度下降时，应立即重新对仪器进行质量轴和分辨率调谐。

8.2 校准

8.2.1 校准曲线的绘制

取一定量抗生素类化合物标准使用液(5.16)、内标物(5.19)及替代物使用液(5.20)于2 ml进样小瓶中，制备不含原点的标准系列(至少5个浓度点)，使抗生素类化合物及替代物的质量浓度分别为2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100 μg/L和200 μg/L(参考浓度)，内标的质量浓度为50 μg/L(参考浓度)。

由低浓度到高浓度依次对标准系列溶液进样，以标准系列溶液中目标组分的浓度为横坐标，以其对应的峰面积(或峰高)与内标物峰面积(或峰高)的比值和内标物浓度的乘积为纵坐标，建立校准曲线。线性回归方程、线性范围和相关系数详见附录。

y=ax+b (1)

式中：x-目标组分浓度，μg/L

y-目标组分和内标物的峰面积(或峰高)比值与内标物浓度的乘积

a- 校准曲线斜率

b- 校准曲线截距

8.2.2 液相色谱/质谱图

8.3 测定

8.3.1 试样测定

按照与绘制标准曲线相同的仪器分析条件进行测定。

8.3.1 空白试验

按与试样测定相同的仪器分析条件(8.1)进行空白试样(7.4)的测定。

9 结果计算与表示

9.1 目标化合物的定性分析

每种被测组分选择1个母离子和2个子离子进行监测。在相同的实验条件下，试样中待测组分的保留时间与标准样品中目标组分的保留时间比较，相对标准偏差的绝对值应小于2.5%;且待测样品谱图中，各组分定性离子的相对丰度(Ksam)与浓度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子相对丰度(Kstd)进行比较，偏差不超过表1规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。12种抗生素类化合物、3种替代物及1种内标物的MRM谱图见附录D。

(2)

式中：Ksam-样品中某组分定性离子的相对丰度，%，

A2-样品中某组分定性离子对的峰面积(或峰高)，

A1-样品中某组分定量离子对的峰面积(或峰高)。

(3)

式中：Kstd-标准品中某组分定性离子的相对丰度，%，

Astd2-标准品中某组分定性离子对的峰面积(或峰高)，

Astd1-标准品中某组分定量离子对的峰面积(或峰高)。

表1 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差单位：%

9.2 目标化合物的定量分析

目标化合物经定性鉴别后，根据定量离子的峰面积，用标准曲线法定量。

9.3 结果计算

根据样品中抗生素各组分的峰面积，对应的内标物峰面积和内标浓度，按照公式(4)计算样品中抗生素的质量浓度。

(4)

式中：ρi-样品中目标组分i的质量浓度，μg/L;

Ai-样品中目标组分i的峰面积(或峰高);

Ais-样品中内标物的峰面积(或峰高);

ρis-样品中内标物的质量浓度，μg/L;

a-标准曲线的斜率;

b-标准曲线的截距;

Vi-定容后体积，ml;

V-水样体积，ml。

9.4 结果表示

测定结果的小数位数与方法检出限保持一致，最多保留三位有效数字。

10 精密度和准确度

10.1 精密度

6家实验室对抗生素浓度为0.0400 μg/L、0.200 μg/L、0.400 μg/L统一空白加标样进行了6次重复测定：

实验室内相对标准偏差分别为：2.8%~11.0%;4.6%~14.0%;5.3%~12.8%;

实验室间相对标准偏差分别为：8.1%~20.6%;11.2%~17.2%;8.1%~16.3%;

重复性限范围为0.009 μg/L ~0.012 μg/L;0.032 μg/L ~0.052μg/L;0.052μg/L ~0.092 μg/L;

再现性限范围为0.013 μg/L ~0.021 μg/L;0.060 μg/L ~0.102μg/L;0.096μg/L ~0.160 μg/L。

10.2 准确度

6家实验室对地下水、地表水、生活污水和工业废水进行加标回收实验，加标浓度分别为0.0400 μg/L、0.200 μg/L、0.200 μg/L、0.400 μg/L。加标回收率范围分别为75.5%~102%，76.3%~88.5%，72.3%~109%，77.5%~90.3%，加标回收率最终值为77.7%±30.5%~102%±31.0%，77.5%±30.6%~85.5%±31.6%，77.5%±25.9%~109%±43.5%，77.5%±27.1%~86.3%±34.8%。

精密度和准确度结果统计见附录E。

11 质量保证和质量控制

11.1 校准曲线

校准曲线的相关系数应≥0.990。

11.2 空白分析

每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出目标组分的浓度应低于方法检出限。

11.3 平行样的测定

每20个样品或每批次(少于20个样品/批)需分析一个平行样。平行样的相对标准偏差应控制在25%以内。

11.4 基体加标

每20个样品或每批次(少于20个样品/批)需做一个基体加标样，加标量为样品中目标组分含量的0.5%~2倍，实际样品加标回收率应在60%—130%之间。

11.5 校准

11.5.1 初始校准