随着经济的快速发展，我国面临着土壤污染严重、土壤镉(Cd)污染日益严重的问题。利用微生物修复土壤Cd污染具有效果好、成本低等优点，受到人们越来越多的关注。而芽孢杆菌环境适应性强，具有高效吸附Cd能力，在修复土壤Cd污染上有一定的潜力，因此深入研究芽孢杆菌对土壤Cd污染修复具有重要的意义。
文章综述了我国土壤Cd污染现状及芽孢杆菌在修复重金属Cd污染的应用，分析了其修复土壤Cd污染的作用机制，并对芽孢杆菌修复土壤重金属Cd污染的存在问题进行展望。
背 景
随着工业快速发展以及人类活动逐渐加强，土壤重金属污染的问题也日益严重，其中土壤Cd污染范围最广、污染程度最严重。由2014年的全国土壤污染状况调查公报可知，我国耕地土壤污染点位超标率为19.4%，且以无机污染物，特别是重金属污染为主。其中重金属Cd点位超标率达到7.0%，是重金属污染物中点位超标率最高的。据统计，每年我国有2000万hm2以上的耕地受镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铬(Cr)、铅(Pb)等重金属污染，受到污染的粮食产量高达1200万t，造成经济损失超过200亿元。Cd是耕地及工业园区、矿区周围土壤重金属污染的最主要来源。表1是部分矿区周围耕地和农作物中的Cd含量状况，从表1可以看出，这部分地区的耕地Cd含量都远远超出该地Cd背景值，且农作物可食部分Cd含量也大部分超过《食品中污染物限量》(GB2762-2012)中规定的食品中Cd含量的限定值，说明这些地区的Cd污染程度相当严重。鉴于我国土壤Cd污染日趋严重，开展修复工作已经刻不容缓。
目前，重金属污染修复方法有物理修复法(客土法、电动修复法、电热修复法)、化学修复法(土壤淋洗法、化学固定技术)和生物修复法(植物修复法、动物修复法和微生物修复法)。物理修复法和化学修复法修复效果好，但是成本高，易造成二次污染，不适于大面积土壤重金属修复。而微生物修复法具有成本低、污染少等优点，再加上国家政策倾斜，使其成为重金属污染土壤修复的重要方向。
常用于土壤重金属修复的菌株有菌根真菌、假单胞菌、光合细菌、芽孢杆菌、酵母菌等，其中芽孢杆菌(Bacillus)因具有较高的环境兼容性，且对重金属Cd具有较好的吸附效果，在土壤重金属Cd污染修复上具有较大的研究价值。本文就其应用及作用机制进行总结，以期为芽孢杆菌用于重金属污染修复提供理论依据。
1 芽孢杆菌在土壤Cd污染修复的应用
大多数芽孢杆菌属为革兰氏阳性菌，在缺乏营养或不良环境时能产生芽孢。常见用于土壤修复剂的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌(Bacillus. subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)等。许多研究发现芽孢杆菌对重金属离子吸附效果明显。表2是几种芽孢杆菌对重金属Cd2+的吸附水平，从表2可以看出，芽孢杆菌对水相中重金属Cd的吸附率比较高，可将其应用到重金属废水、重金属污染土壤的修复中。
降低土壤有效态Cd和植物Cd积累
土壤有效态Cd含量变化取决于土壤Cd不同形态的比例分配。土壤Cd总量越高，有效态Cd的比例越高，植物体内Cd含量也就越高。一些芽孢杆菌不仅可以直接吸附土壤Cd2+，还可以通过影响土壤理化性质来降低土壤有效态Cd含量，从而降低土壤Cd对植物的毒性。
延伸阅读：
枯草芽孢杆菌是土壤中广泛分布的一种需氧型细菌，在防治作物病虫病害、修复重金属污染方面起到重要作用。纪宏伟等研究发现枯草芽孢杆菌可以使土壤有效态Cd含量降低5.07%～42.63%，且培养时间越长，钝化效果越显著。范仲学等通过盆栽试验表明，施用2g/kg的枯草芽孢杆菌对缓解花生Cd胁迫的效果最好，可使籽粒中Cd含量降低25.37%。Jiang CX 等以枯草芽孢杆菌为出发菌株进行诱变，筛选出一株高抗Cd的诱变菌B38，该菌和诺沃肥复合对Cd污染(10mg/kg)的土壤进行修复后，胡萝卜地下部Cd含量下降至0.15mg/kg，土壤中可提取态Cd的含量降低了73.9%。
蜡状芽孢杆菌对Cd、Pb、Cr等重金属具有较强的抗性，可通过静电吸附、离子交换作用、表面络合作用吸附水相中重金属。但蜡状芽孢杆菌用于土壤重金属修复的实例相关报道还不多见。胡永娟利用蜡状芽孢杆菌修复麦田Cr，结果表明小麦幼苗叶和根系Cr含量分别下降8.87%～24.67% ;当蜡状芽孢杆菌与米根霉联用时，可使小麦地上部和地下部Cr含量分别降低42.15%～46.91% 和26.11%～48.24%，土壤有效态Cr含量下降2.1%～9.0%，说明蜡状芽孢杆菌在修复土壤重金属污染方面的应用是具备一定潜力的。目前有关蜡状芽孢杆菌对土壤Cd的修复的实例还比较少，但由于蜡状芽孢杆菌对Cd具有极强的抗性，且对Cd的吸附效果好，使其在土壤Cd污染修复方面的应用具有较大的研究价值。
1.2强化植物修复土壤Cd污染
1.1微生物-植物联合修复是目前常见的土壤重金属污染修复方法之一，微生物能够改善土壤环境，解决土壤中重金属的生物有效性较低而限制植物修复发展的问题。有研究表明，某些芽孢杆菌接种于土壤后，能促进植物生长，提高土壤有效Cd含量，很大程度上提高植物修复效率。
巨大芽孢杆菌、胶质芽胞杆菌具有解磷、解钾的功能，能促进植物生长，在代谢过程中可产生有机酸，对土壤重金属有一定溶解活化作用。王小敏等研究表明，不同Cd污染水平下巨大芽孢杆菌可使土壤中有效态Cd含量提高3.8%~24.4%;将其与印度芥菜联合修复土壤Cd污染，可使印度芥菜Cd含量提高13.9%~96.9% ，印度芥菜地上部Cd含量最高增加42.1%，土壤中可交换态Cd含量最高增加10.7%。杨榕等考察了不同接种量条件下胶质芽孢杆菌对印度芥菜修复Cd污染土壤的影响，结果表明，不同浓度的胶质芽孢杆菌可使土壤Cd含量降低4.7%~20.9%，同时能提高根际土壤有效态Cd含量15.15%~36.54%，非根际土壤有效态Cd含量提高31.73%~45.28%。
2 芽孢杆菌修复Cd污染土壤的作用机制
2.1胞外吸附
芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁中含有大量肽聚糖和磷壁酸，因此能够提供大量的羧基、酰胺基等活性基团，这些基团可以失去质子而使菌体表面带有较强负电荷，使之能靠静电引力吸附重金属离子。例如，在蜡状芽孢杆菌吸附Cd饱和平衡后，pH 值的升高或降低会改变菌体吸附Cd的解吸率以及细菌表面所带电荷，说明静电吸附对蜡状芽孢杆菌吸附重金属Cd起到一定作用。同时，在细胞吸附重金属离子过程中，细胞壁会与重金属离子进行离子交换，置换出其他阳离子。在蜡状芽孢杆菌吸附Cd后，上清液中K+、Na+、Mg2+和Ca2+离子含量增加，说明发生了离子交换作用。
重金属阳离子与分子或带有自由电子的阴离子能够发生络合、螯合作用。芽孢杆菌表面带有大量的阴离子活性基团，如-OH、-COOH能吸附重金属离子形成重金属配合物，降低迁移率。刘红娟等筛选到一株对Cd具有较高抗性和富集能力的蜡状芽孢杆菌，通过红外光谱分析发现，蜡状芽孢杆菌细胞壁上活性基团-OH、-NH-、-COOH、-PO43- 和-M-O(O-M-O)(M 为金属离子)与重金属Cd2+的络合密切相关。孙静等通过考察地衣芽孢杆菌富集镉的特性及机理，发现地衣芽孢杆菌对Cd2+的吸附以表面吸附为主，细胞壁上的羧基、羰基、酰胺基含有大量孤对电子，能成为Cd2+的电子供体，发生络合作用，从而实现对Cd的富集。
吸附在芽孢杆菌表面的Cd离子能够与可溶性或不可溶性的生物多聚物发生螯合作用，形成Cd(OH)2、Cd3(PO4)2、CdS、CdCO3等沉淀，使重金属固定。孙静等通过扫描电镜观察Cd胁迫下的地衣芽孢杆菌发现，地衣芽孢杆菌细胞壁存在大量含Cd2+的颗粒。刘红娟等发现，在Cd浓度为150mg/L的条件下，蜡状芽孢杆菌的细胞壁和菌体表面有大量Cd沉淀物存在，无Cd条件下则没有。芽孢杆菌在含高浓度Cd的液体培养基中培养时能在细胞表面形成沉淀或吸附Cd沉淀，从而富集重金属Cd。
2.2胞内积累
芽孢杆菌胞外吸附重金属Cd离子，再通过依赖能量的转移系统将Cd运送到细胞内，可能通过外排作用或在细胞内形成沉淀来降低重金属Cd对细胞的毒害。Surowitz 等研究了枯草芽孢杆菌1A1原生质体对Cd2+离子的吸附，发现Cd2+离子的积累与细胞代谢有关，当存在抑制剂氰化钾时，枯草芽孢杆菌原生质体对Cd2+离子的吸附能力远远降低，表明枯草芽孢杆菌1A1可以通过主动运输的方式将Cd2+离子运送至细胞内。此外，Cd2+可被作为Mg2+、Zn2+等结构类似物通过离子通道运到细胞内。有研究人员通过透镜电镜观察高浓度(1000mg/L)Cd条件下培养的地衣芽孢杆菌，发现菌体表面凹凸不平，细胞壁上和细胞内含有大量大小为50nm左右的Cd沉淀颗粒。
有研究表明，几乎所有微生物细胞内的蛋白质、多肽等大分子对重金属都有很强的结合能力。利用圆二色光谱分析不同浓度Cd胁迫下菌体蛋白质分子二级结构的变化，结果发现高浓度Cd胁迫下地衣芽孢杆菌的蛋白质空间构象发生了变化。
延伸阅读：
芽孢杆菌吸附富集Cd的过程可能受到基因调控，相关研究认为蜡状芽孢杆菌的抗Cd基因是由质粒控制的，经过消除质粒处理的蜡状芽孢杆菌对高浓度(200mg/L)Cd不具有抗性。而Solovieva 等对枯草芽孢杆菌的抗Cd性能研究发现，Cd2+能够诱导一个位于染色体上2.2kb CadA的转录，该基因在枯草芽孢杆菌上是Cd2+ 抗性染色体决定子。微生物吸附重金属的机制十分复杂，不同微生物吸附机理也不单一，其具体机理还有待进一步研究。
目前，微生物吸附重金属的研究大多侧重于细胞的表面吸附机制，而细胞内代谢活动对Cd吸附影响的研究较少。芽孢杆菌胞内Cd的积累有利于环境中Cd的去除，但过量Cd会抑制菌体活性，因此寻求耐Cd能力较高的菌株仍是研究人员不断努力的目标。
2.3胞外聚合物促进Cd吸附
微生物在一定条件下能分泌高分子聚合物(如蛋白质、多糖、核酸等)，这些生物大分子即细菌胞外聚合物(EPS)，对重金属有很强的吸附能力。Fang 等认为细菌结合态EPS官能团类型与枯草芽孢杆菌表面活性基团类型一致，EPS存在能明显提高菌体表面活性基团浓度。枯草芽孢杆菌EPS能通过络合、离子交换、沉淀等方式提高枯草芽孢杆菌对重金属离子的吸附作用，去除EPS后的枯草芽孢杆菌对Cd2+的吸附量下降51.4%。EPS的存在还能增强细菌的粘附强度，促使细菌快速吸附于土壤矿物颗粒上。Huang等研究表明，将细菌接种到土壤中，土壤胶体表面积增加3.0%～8.8%，表面所带负电荷增加，促进对Cd的吸附。
2.4小分子有机酸提高Cd的生物有效性
微生物通过各种代谢活动产生多种低分子量的有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸等)，能影响土壤中重金属沉淀-溶解平衡，从而改变重金属在土壤中存在形态的分布。杨卓等利用反向高效液相色谱测定巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌发酵液中的有机酸成分，发现在发酵过程中巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌能产生柠草酸、檬酸、苹果酸等有机酸，而这些有机酸能改变土壤Cd存在形态，提高土壤中Cd的生物有效性。芽孢杆菌通过代谢活动产生的有机酸能活化土壤重金属Cd，影响植物对Cd的吸收，可用于微生物强化植物修复土壤重金属Cd污染的研究。
2.5改变土壤理化性质
芽孢杆菌不仅可以直接吸附重金属离子，还可以通过影响土壤理化性质(包括土壤pH、阳离子交换量、有机质含量、氧化还原电位、土壤微生物等)来改变重金属在土壤中不同形态的分布。杨榕等研究发现胶质芽孢杆菌能分泌有机酸，降低植物根际土壤pH，从而提高土壤有效态Cd的含量，进一步证实了土壤有效态Cd与土壤pH呈负相关。胶质芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的解磷、解钾作用能增加土壤中的阳离子交换量，而阳离子交换量越高，说明土壤胶体的负电荷量越高，通过静电吸附的Cd2+就越多。
2.6结语
芽孢杆菌对土壤Cd的修复机理见图1，由图1可知，芽孢杆菌对Cd的修复包括：(1)Cd2+通过静电吸附作用被吸附到细胞表面，与表面活性基团发生络合作用形成金属络合物;(2)Cd2+与芽孢杆菌表面的Ca2+、K+等阳离子发生离子交换;(3)细胞表面沉淀或吸附沉淀有利于Cd2+的稳定化;(4)芽孢杆菌通过主动运输积累Cd2+;(5)代谢分泌物作用，EPS对Cd2+的吸附作用以及有机酸对Cd沉淀的溶解活化作用 。
3 问题与展望
芽孢杆菌对Cd、Pb、Cr等重金属有较强的吸附作用，且在改善土壤理化性质和降低土壤重金属含量方面表现出积极效果，在Cd、Pb、Cr等重金属污染土壤修复的发展前景十分广阔。然而，芽孢杆菌在修复土壤重金属污染方面的应用还处于初级阶段，仍需从以下几个方面进行深入研究：
(1)利用基因工程、细胞工程等生物技术手段提高芽孢杆菌对Cd的耐受性和吸收性，对具有修复能力的菌株进行优化培养，使之达到最优的生物修复效果。
(2)芽孢杆菌修复重金属Cd污染的作用机制比较复杂，需要进一步研究芽孢杆菌与土壤矿物颗粒、植物分泌物的相互影响，以改善修复效果。
(3)巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌等能活化土壤重金属Cd，增加Cd在土壤中的转移性，容易引起土壤和水体的二次污染。应深入研究修复剂施用方法，最大程度地提高芽孢杆菌辅助植物修复土壤Cd污染的效率。
(4)目前芽孢杆菌修复土壤Cd污染的研究多数是在实验室或小规模田间进行，在推广应用前，应结合大田试验。
延伸阅读：
原标题：芽孢杆菌修复土壤重金属镉污染的研究进展
