摘要：石油类物质进入到土壤中不仅破坏原来生态系统，而且严重损害身体健康。目前，针对石油污染土壤微生物修复手段是一种新兴实用的污染物治理技术，主要包括：生物刺激、生物强化、固定化微生物技术和植物-微生物联用技术。其具有成本低、效率高、消耗少、对环境影响小和无二次污染的优点，正逐步成为石油污染土壤治理的热点领域，然而微生物修复技术在环境中应用也同时具有不确定性和潜在的风险。文章着重介绍国内外目前主要的微生物修复手段的研究成果及进展情况，并对微生物修复技术的发展进行了合理展望。
目前认为石油污染土壤的形成途径有三种：① 落地油污染;② 污水排放和灌溉;③ 空气污染。石油一旦污染土壤，自然修复过程十分缓慢，其理化性质以及土壤机械组成等会发生改变，进而直接或间接地影响农作物生理过程。20世纪80年代以前，处理石油污染土壤的主要方法是物理或化学方法，这些方法不仅成本高，且后续处理比较困难。80年代以来，人们将注意力转向生物法治理石油污染土壤，通过改变生物外部生活环境和依照生物自身的遗传变异规律提高石油降解速度和程度，具有手段多样化、降解程度高、代谢旺盛且代谢物无毒害的特点，被认为是生态环境保护领域最有价值和对土壤修复较为彻底、最有前途的污染修复技术。
环境中降解石油的微生物
自然界中能降解石油烃的微生物广泛存在于土壤圈、水圈等圈层中。许多微生物有以石油烃为唯一碳源和能源而生长的能力。目前已发现100多个属、200多种微生物能够氧化降解一种或多种石油烃类。目前研究表明，能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌。在海洋生态系统中的石油烃类降解主要依靠细菌，而在淡水和陆地生态系统中的石油烃类降解中占主导地位的则为真菌。运用微生物治理石油污染是因为其特点是：种类多、分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异等。
微生物降解石油时，其内部发生一系列酶促反应，会产生氧化还原、脱羧、脱氨、脱水等作用，因此对于石油降解、物质能量利用会更加高效。微生物高繁殖率以及遗传变异性大使它的酶体系能够以最快的速度适应外界环境的变化，从而使微生物在环境治理上显示出高效性和多样性，又避免了二次污染的问题。土壤中常见的石油降解细菌属名列表如下：
降解石油化合物的微生物属名
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细菌
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真菌
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无色杆菌属Aomobacter
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分支杆菌属
Mycobacterium
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枝顶孢属
Acremonium
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拟青霉属
Paecilomyces
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不动杆菌属Acinetobacter
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细杆菌属
Microbacterium
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曲霉菌属
Aspergillus
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青霉菌属
Penicillium
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产碱杆菌属
Alcaligenes
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诺卡氏菌属
Nocardia
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白僵菌属
Beauveria
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茎点霉属
Phoma
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节细菌属
Arthrobacter
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变形杆菌属
Proteus
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葡萄孢属
Botrytis
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红酵母属
Rhodotorula
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放线菌属
Actinomycetes
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假单胞菌属
Pseudomonas
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假丝酵母属
Candida
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酵母属
Sacomyces
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芽孢杆菌属
Bacillus
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沙雷氏菌属
Serratia
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金孢子菌属
Chrysosporium
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齿梗孢属
Scolecobasidium
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短杆菌属
Brevibacterium
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螺菌属
Spirillum
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枝孢属
Cladosporium
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穗霉属
Spicaria
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色杆菌属
Chromobacterium
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链霉菌书
Streptomyces
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旋孢腔菌属
Cochliobolus
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弯颈霉属
Tolypocladium
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棒状杆菌属
Corynebacterium
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弧菌属
Vibrio
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柱孢属
Cylindrocarpon
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粘囊孢属
Graphium
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纤维菌属
Cytophage
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得巴利氏酵母属
Debaryomyces
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腐质霉属
Humicola
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棒状杆菌属
Coryneforms
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镰刀菌属
Fusarium
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被孢霉属
Mortierella
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欧文氏菌属
Erwinia
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地丝菌属
Geotrichum
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木霉属
richoderm
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黄杆菌属
Flavobacterium
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胶枝霉属
Gliocladium
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微球菌属
Micrococcus
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念珠菌属
Monilia
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其中假单孢菌属(Pseudomonas)、节核细菌属(Arthrobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、无色杆菌属(Aomobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属 (Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、分支杆菌属 (Mycobacterium);气单胞菌属(Aeromonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、蓝细菌属(Cyanobacteria)、红球菌(Rhodococcus)和弧菌属(Vibrio)能够很好地降解石油烃;而常见的石油降解真菌属为木霉属(richoderma)、青霉属 (Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、被孢霉属(Mortierella)等。
石油污染土壤的几种主要微生物修复技术
自20世纪70年代以来，随着石油年产量逐年增加，在2008年达到石油生产顶峰。石油污染土壤的微生物修复技术逐渐成为治理石油污染的核心技术。利用石油污染土壤环境中的土著菌种或者是向受污染的土地中施加经过驯化后的微生物，在C/N比适当的情况下，其内部能将石油类物质中的烃类代谢为不饱和脂肪酸同时产生某些双键的位移或产生甲基化，形成脂肪酸，加速新陈代谢，在氧气充足的作用下，发生氧化作用，脱氢生成水和CO2，营养元素供微生物自身生长并释放能量，达到降解土壤中的石油烃的目的。简单来说，这一过程可用下式表示：
石油类物质+生物+O2+N源→CO2+H2O+副产物+细胞体。
目前，国内外对于石油污染土壤微生物修复技术主要包括：生物刺激、生物强化、固定化微生物、微生物-植物联用等方法。
生物刺激
生物刺激法是人为的利用某些手段对石油污染土壤中的土著菌进行刺激，促进其繁殖与生长，如向土壤中通气、添加肥料或者投入其他添加剂，来加速微生物生理活动，以便达到对石油污染土壤进行降解的一种手段。其主体是土著菌，途径是改变微生物外界生长环境。由于自然环境中微生物种类繁多，因此各种微生物对于石油污染土壤的降解方法、理化反应也不尽相同。但基本途径却基本相同：
① 石油类物质被微生物细胞膜吸附;
② 石油类物质进入微生物内部;
③ 石油类物质参与微生物生理反应，微生物进行酶促反应将石油类物质分解成为CO2、H2O及无污染无毒物质。
目前，国内外对生物刺激法进行许多研究。实验表明，不同的生物刺激手段，例如通气、添加营养物质、电子受体、表面活性剂等，能够不同程度的提高微生物对污染土壤中石油类物质的降解程度，具体见表2。这种方法优点是，操作简便修复后无二次污染，应用前景具有很大潜力;不足之处是不同环境土壤构成、质地等不同，其土著菌种所需营养物质等外部条件不同，操作时应选择与当地土壤环境相适应的刺激手段，以便达到更好效果;另外，土著菌种由于生长速度较慢，代谢活性不高，直接影响石油降解效果。
不同具体方法的石油去除率
生物强化
目前，生物强化与生物刺激均属于目前国内外比较有发展潜力的修复技术。生物强化修复技术主要包括外源微生物的生物强化和本土微生物的生物强化。外源微生物认为是由于生物刺激法具有一定的环境因素的局限性，因此在石油降解的过程中，为了提高石油物质去除率，常常引入其他高效降解菌种。这些菌种基本不属于自然环境下的土著菌种，而属于外来菌种。因此在接种初期，势必会受到接种环境中土著菌种的竞争，修复过程中需要大量的接种微生物形成优势种，投菌法应注意氮和磷是土壤微生物治理系统中最主要的营养元素，微生物生长所需的C、N、P的质量比大致为100：10：1。本土生物强化技术是由日本科学家Ueno等在2007年首次提出的，主要指从石油污染的土壤中分离出具有石油降解能力的本土微生物，将其培养富集后重新投入到石油污染土壤中进行生物强化试验，降解石油类物质的技术。
不同具体方法的石油去除率
近年来，人们逐渐重视和采用生物遗传工程手段研究和构建高效的基因工程菌。具体所采用的手段有：构建多个质粒的菌种、降解性质粒DNA的体外重组和原生质体融合技术等。利用生物强化修复手段，可以修复一些极端的不利于大多数微生物存在和生长的环境。研究表明，生物强化技术的优点是可以非常显著的提高石油类物质的降解效率，具体见表3。表中显示，经过生物强化技术修复后的土壤，石油类物质去除率明显增加。不足之处在于投入的微生物易受土壤环境的理化性质和生物学特性影响，从而在很多情况下限制了生物强化技术的应用。因此，如何优化生物强化修复体系和研究出更适合的生物强化修复方法，使得微生物更容易适应不同的自然环境则成为近年来研究的热点。
固定化微生物技术
微生物固定化技术(immobilized microorganism, IM)是指利用化学或物理的方法，将游离的微生物或酶固定在适当的载体中，主要优点是：对进行石油降解的微生物进行固定，可以避免人为的破坏生物体细胞和生物酶活性以及进行生化反应的稳定性，解决了微生物在污染环境中容易受到外部环境条件波动的影响，提高了单位介质中的微生物数量;固定化后的微生物能长期保持活性，其生长繁殖的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对外源菌种的恶性竞争、吞噬和毒害，提高固定化微生物的生存能力，使其在复杂、极端环境中仍可以稳定地降解石油类物质。
近年来，研究者们通过实验筛选出很多不会对土壤造成二次污染、对环境友好且可以自然降解或不可降解的载体，如花生壳粉末、活性炭、天然有机材料等来固定微生物菌体，解决了载体在土壤环境中不易回收的问题，同时也提高了石油类物质的去除率，见表3。选择载体时，应注意以下几个原则：
① 具有很强的机械和理化性质;
② 具有较强惰性，不干扰微生物功能;
③ 具有一定容量;
④ 物美价廉。
不同具体方法的石油去除率
从表4可知利用固定化微生物修复技术修复土壤中的石油污染，其石油去除率明显高于同等条件下利用生物强化与生物刺激的方法。目前IM技术主要用于流体介质(如废水)和半流体介质(如污泥)中，在非流动介质(如污染土壤)的运用则是刚刚兴起，具有很好的发展前景。IM技术的主要优点是去除效率较高，充分利用微生物的生物活性。缺点是固定化微生物修复载体在土壤中的不可回收给自然环境带来了一定的风险，另外复杂成分的载体材料、微生物以及石油类物质之间的相互作用对分析降解有机污染物的机理带来困难。因此，在今后的研究方向主要集中于：
① 继续寻找合适的、对环境有好的载体材料，载体应有足够好的强度、惰性;
② 研究载体材料、微生物、石油类物质之间相互作用;
③ 研究载体材料应降低成本，简化载体制作流程，向利于技术的传播与应用方向发展;
④研究应向混合微生物固定化、基因工程菌种固定方向发展，提高石油降解率;
⑤ 研究和评估固定化载体对环境影响风险等。
植物-微生物联用技术
在自然条件下生物刺激、生物强化以及固定化微生物修复技术受环境条件制约程较大，或者有些只能在实验室中进行，因此污染土壤微生物修复技术效果的关键所在是选择最佳生态环境条件。相对于单纯的利用微生物进行土壤污染修复，植物-微生物联用技术是指植物与微生物互利作用来强化根际，实现提高有机物降解效率。其机理为植物根际为微生物提供生长场所，输送氧气，使微生物氧化作用可以正常进行，同时根际分泌物质某种程度上可以刺激或加速微生物的降解功能;反过来微生物可以将污染物质转换成植物可以利用的简单化合物，降低污染物质毒性，通过植物根的吸收作用同样达到了降解石油的目的。
在植物-微生物联合修复体系中，理想的植物应具备:
① 具有旺盛的须根系，并最大可能地提供微生物活动的根表面面积;
② 生长旺盛，对多种有机污染物表现一定抗性;
③ 根系可以伸展到较深土层中。
近年来，研究者做了大量工作筛选出多种对石油有降解能力的植物和微生物组合来修复石油污染土壤。中国科学院南京土壤研究所选用紫花苜蓿作为宿主植物，对长期持久性有机污染物(POPs)复合污染土壤同时接种根瘤菌剂和菌根菌剂，改善植物根区微生态环境，增强污染土壤中持久性有机物的转化能力，明显提高了土壤中污染物质的降解或消减效果;徐莉等选择紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，同时接种苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)或/和地表球囊霉(Glomus versiforme)，在田间试验对多氯联苯(PCBs)污染土壤的修复效果，结果表明：所有种植植物的处理,根际土壤PCBs的去除率均高于对照，其中紫花苜蓿并接种根瘤菌处理的土壤，PCBs去除率最高，达到42.6%;马强等选择水稻-微生物联合处理下土壤中石油烃的降解速率最快，培养期内的降解效率达到53.13%;马溪平等选择芥菜、玉米和蓖麻皆能减少土壤总烃类含量，降解率都在60%以上。
微生物与植物之间存在诸多联系，两者有机结合才能使石油类物质降解达到最大化，了解二者之间共同作用机理，可以完善二者的联合程度，提高石油降解效率。目前，植物-微生物联合作用机理研究主要集中在：
① 根际改善微生物生长的微生态环境，改善土壤理化性质;
② 植物根际分泌物质刺激、强化微生物降解作用，或分泌酶直接参与对污染物质进行降解的过程中，起到对污染物质的活化作用;
③ 微生物强化植物根际的矿化作用。由于植物-微生物修复技术成本相对较高，技术含量高，影响植物、微生物的因素均能影响修复效果。
在今后的实验中，可能更加深入的研究有：
① 植物与微生物菌种的合理搭配，改进工艺，降低成本;
② 污染土壤中植物与微生物协同修复原理，特别是联合修复机制、控制因素的研究;③ 外源微生物与土著微生物稳定共生条件及环境响应因子的研究;
④ 菌根根际微生物生理特征及生活习性，污染物种类和浓度对菌根根际物质和能量流动的影响研究。
作者单位为哈尔滨师范大学湿地过程与环境效应实验室
原标题：【干货】微生物修复石油污染土壤的4类核心技术
