摘要：从城市污水处理厂的活性污泥中驯化分离出2 株耐盐高效菌：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）O1 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Y5 制备复合菌剂，用于高盐生活污水生物处理工艺快速启动研究｡研究表明，在SBR 系统中连续投加复合菌剂（制备的配比为1 ∶ 1），在30 d 完成快速启动（TOC 去除率> 85%），并且在整个启动过程中，TOC 的去除率都能够稳定保持在80%左右，而负载复合菌剂填料的投入可获得更稳定的出水水质｡通过高通量测序与OTU 分类，高盐废水的配入使得活性污泥微生物群落结构发生显著改变，并且在工艺启动后，所投加的耐盐高效菌O1 和Y5 在活性污泥微生物总量中所占比例由1. 31%升高至6. 13%，说明O1 和Y5 能够在小试SBR 中长期存留，并逐渐成为优势种属之一｡
关键词：高盐废水；耐盐复合菌剂；快速启动；高通量测序；微生物群落结构
高盐废水是指总含盐（如Na +､K +､Cl - 和SO2 -4等）质量分数≥1%的废水[1-2]｡近年来一些沿海城市积极开展海水的直接利用（如海水用于冲厕､冲洗道路､消防以及工业冷却水等），预计到2020 年，全国海水直接利用量将达到1 × 109 m3·a - 1[3]，海水直接利用量的快速增长是导致高盐废水大量排放的一个重要原因｡目前，高盐废水最主要的处理方式是通过市政管网进入城市污水处理系统｡高盐废水通常包含Na +､K +､Cl - 和SO2 -4等盐类物质，这些离子浓度过高，会快速增大细胞渗透压从而破坏菌体细胞，同时产生盐析作用降低脱氢酶活性抑制细菌生长，而且高浓度的氯离子对细菌有一定地毒害作用[1-2]｡因此，高盐废水会对传统污水生物处理工艺产生明显的抑制作用[4]，特别是在生物处理工艺的启动期，活性污泥受到抑制会导致工艺出水水质恶化，COD 和SS 浓度剧增｡生物工艺处理高盐废水的最大问题在于微生物的代谢功能遭到破坏，原后生动物数量剧减，污泥驯化缓慢，反应器启动时间较长[5-7]｡常丽丽等[8]研究了含盐废水生化处理耐盐污泥驯化，发现驯化初期城市污水处理厂的污泥对含盐废水中COD 的去除率仅为30% ~ 40%，经过80 d 的驯化后COD 去除率才能达到90%｡宋晶等[7]直接驯化嗜盐菌处理高盐废水，采用序批式生物膜法（sequencing batch biofilm reactor，SBBR），通过逐步提高盐度的方法模拟高盐废水的处理，出水COD 能够达到90% 以上，但嗜盐菌的驯化与扩培缓慢导致SBBR 很难快速启动[7]｡HAMODA 等[9]研究发现高盐环境并未完全抑制微生物生长，相反会促进一些嗜盐细菌的生长；KARGI等[11-12]发现通过投加嗜盐微生物能够加速微生物群落结构的演替，从而缩短污泥驯化的过程｡通过投加复合菌剂进行生物强化成为了高盐废水处理研究的热点｡张波等[13]制备复合嗜盐菌剂强化处理高盐有机废水，中试实验结果表明，投加复合嗜盐菌剂能够加快厌氧反应器的启动，在70 d 内就完成了启动过程，且复合菌剂能够有效改善生化系统对TOC 的去除效果，对TOC 的去除率由投菌前的50%左右提高至70%以上｡大多数研究仅通过污染物去除效率来描述生物强化的效果，复合菌剂对活性污泥微生物群落机构演替的作用以及其能否在反应器中长期存留，均需要进一步研究与探讨｡
本研究依靠投加外源耐盐高效复合菌剂，改善生物处理工艺启动期处理效果，实现高盐废水生物处理工艺的快速启动｡采用分子生物学的方法分析启动与完成阶段活性污泥生物群落结构的变化，考察耐盐高效复合菌剂在反应体系内的存留时间，为开发高盐废水生物处理工艺提供技术支持｡
1 实验部分
1. 1 耐盐高效菌与复合菌剂制备
耐盐高效菌：本研究采用的耐盐菌是由本实验室筛选获得的耐盐高效菌O1 和Y5[14]；地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis） O1 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） Y5 均可降解高盐废水中的有机物，具有耐盐､适用pH 值范围宽､适用温度范围宽的特点[14]｡
LB 液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 50 g，Milli-Q 水1 000 mL；LB 固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 50 g，琼脂15 g，Milli-Q 水1 000 mL；在LB 液体和固体培养基中分别加入45 g 和65 g的NaCl，配置含盐量5%和7%的高盐LB 培养基，用于复合菌剂的制备与扩培｡
亲水性聚氨酯生物填料：密度约为23 kg·m - 3，孔径为2 ~ 3 mm，孔隙率> 90%，比表面积23. 3 × 103m2·kg - 1，微生物负载量16 ~ 20 kg·m - 3｡
复合菌剂的制备：将已经筛选获得的耐盐高效菌O1 和Y5 分别接种到盐度为5%和7%的LB 液体培养基中，在25 ℃､150 r·min - 1的条件下培养，每隔2 h 测定OD600，当菌株Y1 和Q5 的OD600值分别达到3. 10 和1. 39 时，由画线法可测得LB 液体培养基中的菌浓度达到107 CFU·mL - 1｡将分别含有2 株菌的LB 液体培养基按1∶ 1 体积比混合[14]，离心并撇除上清液，加入PBS 缓冲液冲洗3 次，其菌含量约为1 gMLVSS·L - 1｡
复合菌剂的负载：将分别含有2 株菌的LB 液体培养基按1 ∶ 1 体积比混合，同时加入边长为1 cm 的聚氨酯立方体1 g，在25 ℃，150 r·min - 1 的条件下培养12 h 即完成了复合菌剂的固定化，取出聚氨酯立方体，用PBS 缓冲液冲洗3 次，其负载量约为0. 8 g MLVSS·g - 1｡
1. 2 实验装置及运行
实验采用的SBR 装置（ 见图1） 呈圆柱体，由有机玻璃制成，有效高度为70 cm，内径为19 cm，有效容积为5 L；反应器底部设有微孔砂盘曝气器，曝气量由转子流量计调节；反应器上方设有搅拌器；反应器进水､出水､曝气及搅拌均通过时控开关自动完成，而排泥则通过手动完成｡
3 个平行运行的SBR 中R1 和R2 作为实验组，分别投加复合菌剂和负载复合菌剂的填料进行生物强化，R3 作为对照组只保持相同生物量的活性污泥｡3 个SBR 的水力停留时间（HRT） 均为12 h，排水比为1 /2，其中每个循环6 h，包括进水0. 5 h，缺氧反应1 h，好氧反应3 h，排水0. 5 h 以及闲置0. 5 h｡污泥浓度（MLSS） 控制在3 500 ~ 5 500 mg·L - 1，好氧反应末端溶解氧（DO）控制在6 ~ 8 mg·L - 1，温度为25 ~ 28 ℃｡
1. 3 接种污泥与实验用水
实验所用活性污泥取自市政污水处理厂的二沉池｡实验用水取自生态环境研究中心家属区生活污水，投加粗盐配成盐度为3% ~ 5% 的高盐生活污水，原生活污水常规水质指标见表1｡
1. 4 DNA 提取及群落结构分析
DNA 提取与PCR 扩增：4 mL 污泥样品10 000 r·min - 1离心10 min｡使用Fast DNA SPIN for Soil 试剂盒（MP Biomedical，France）按提取说明操作｡提取的DNA 在Nano 分光光度计（Nano，USA）上测定DNA 的浓度和质量，并使用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA 的完整性｡采用PCR 对16S rRNA 的V4 区进行扩增，引物为515F（5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’），反应条件为95 ℃预变性2 min；之后95 ℃变性30 s､55 ℃退火30 s､72 ℃延伸30 s 共循环25 次；最后72 ℃保持5 min｡PCR 反应体系为20 μL，包括4 μL 5 × FastPfu Buffer､2 μL 2. 5 mmol·L - 1 dNTPs､0. 8μL 上下游引物（5 μmol·L - 1）､0. 4 μL FastPfu 聚合酶和10 μg DNA 模板｡
高通量测序与OTU 分类：采用Illumina Miseq 平台（Illumina，USA）测序分析，测序数据经优化后，每个样品含有28577 条有效序列｡有效序列采用Ribosomal Database Project （RDP） 分类｡Circos 图采用Circos 软件（ http：/ /mkweb. bcgsc. ca /tableviewer /） 绘制；主成分分析（PCA） 采用Canoco 5. 0 绘制（Microcomputer，USA）；热图（Heatmap）采用Hemi 1. 0（http：/ /hemi. biocuckoo. org /）PCA 和热图是基于前含量前10 位菌属绘制｡
1. 5 水质分析项目及方法
TOC：element 元素分析仪测定；DO：YSI550A 溶氧仪测定；pH：SartoriusPB-20 pH 计测定；TDS､MLSS､MLVSS：重量法｡
2 结果与讨论
2. 1 复合菌剂投加量优化
采用250 mL 摇瓶实验考察不同复合菌剂投加量的SBR 对TOC 的降解效果，从而实现复合菌剂投加量优化｡培养条件：转速为150 r·min - 1，25 ℃；将活性污泥接种于摇瓶中，接种量为2 040 g MLVSS·L - 1；采用批次换水，停留时间8 h｡48 h 后出水的TDS 基本稳定，按表2 方法投加复合菌剂，并且停止换水｡取样周期为2 h，连续采样24 h｡样品离心并过0. 45 μm 滤膜，测定TOC 值｡
由图2 可知，随着复合菌剂投加量的增加，投加复合菌剂的生物强化系统（ bio-augmentation system，BS）的TOC 降解速度逐渐加快，最大降解率也有所增强｡投加1%､5%､10% 和15% 复合菌的由于投菌量由10%增加到15%，TOC 去除速率与最大去除率均没有显著提高，说明投菌量增加到一定程度后，对系统降解速度和降解效果影响变化不大[11，15]，所以反应器运行选择10%投菌量｡
2. 2 复合菌剂对SBR 启动的影响
反应器启动共分为3 个阶段｡第一个阶段图2 不同的复合菌剂投加量对TOC 去除的影响Fig. 2 Effect of different dosages on TOC removal（1 ~ 15 d），反应器中接种城市污水处理厂活性污泥，接种量约为2 000 mg MLVSS·L - 1，并采用普通生活污水作为进水，直到3 个SBR 的TOC 去除率均稳定达到85%以上；第二个阶段（16 ~ 25 d），采用高盐生活污水作为进水，进行复合菌剂与投加，对R1和R2 每隔1 d 各自投加10% × MLVSS 的复合菌剂和菌填料，共投加5 次；第三个阶段（26 ~ 45 d），保持SBR 的正常运行直到R1 和R2 的TOC 去除率再次稳定达到85%以上｡
从图3 可以看出，在SBR 处理高盐生活污水启动期，投加复合菌剂及菌填料对SBR 的TOC 去除率图3 SBR 快速启动过程中TOC 的去除效果Fig. 3 Efficiency of TOC removal during SBR start-up period有非常显著的提高[7，12-13]，第15 天到25 天，复合菌剂投加过程中，R1､R2 的TOC 去除率能够稳定在80%左右，而R3 的TOC 去除率仅仅从25% 提升至40%；第26 天至45 天，SBR 运行过程中，R3 的TOC去除率并没有显著的提高，直到40 d 才出现缓慢提高的趋势｡第35 天以后，R1 和R2 的TOC 去除率均可以稳定在85% 左右，可认为SBR 处理高盐生活污水启动完成[5]，而直到65 d，R3 的TOC 去除率仅为图4 SBR 快速启动过程中MLSS 和MLVSS 的变化Fig. 4 Change of MLSS&MLVSS during SBR start-up period65. 3%｡此外，对比R1 和R2，在第二阶段的出水TOC 呈现出一致性，而在第三阶段，R2 的运行状况明显更加稳定，这也说明投加负载菌填料能够为复合菌剂提供更加稳定的环境[16-17]，悬浮填料表面即可观察到一层褐色黏膜附着，证明微生物开始附着生长，生物膜逐渐形成｡
SBR 快速启动过程中MLSS 及MLVSS 的变化规律如图4 所示｡R1､R2 和R3 的MLSS 及MLVSS 整体均呈现出先下降，后上升的趋势｡这是由于起初活性污泥微生物受到高盐度的抑制甚至毒害，导致生物量降低，而随着污泥的驯化，嗜盐微生物逐渐开始增殖[7-8]｡值得一提的是R2 的MLSS 剧减，可能是由于投入填料后，部分微生物附着在填料上，从而导致反应器内悬浮固体浓度减少｡此外，R1､R2 和R3 MLVSS/MLSS 的值由0. 068 5 分别降低至0. 623､0. 624 和0. 561，有研究证明高盐废水下的活性污泥絮体致密､沉降性能好，这可能是盐在嗜盐微生物体内富集导致的[7，10]｡
2. 3 SBR 群落结构分析
对SBR 中活性污泥进行了高通量测序用于揭示反应器菌群结构演替以及复合菌剂的存留状况｡群落结构分析的4 组实验包括配入高盐废水前期（R1､R2 和R3 完成接种后在相同条件下运行，样品编号Rday15），连续投加复合菌剂的R1 组（样品编号R1 day25､R1 day35､R1 day45），连续投加复合菌剂的固定化填料的R2 组（样品编号R2 day25､R2 day35､R2 day45）；连续投加活性污泥的R3 组（ 样品编号R3day25､R3 day35､R3 day45）｡不同处理组及采样阶段，菌门水平变化如图5 所示｡活性污泥微生物中含量最多的为变形菌门（ Proteobacteri） 和拟杆菌门（ Bacteroidetes），其所占比例最高，分别达到40. 45%､27. 05%､4. 69%和4. 22%｡在整个生物处理启动过程中，高盐废水对活性污泥的驯化以及复合菌剂的投入使活性污泥微生物群落结构发生了明显的改变[18]｡活性污泥中主要微生物比例发生了明显改变，R1､R2 和R3 中变形菌门所占比例均出现骤增，分别达到56. 24%､56. 22% 和63. 72%，拟杆菌门所占比例则分别降低至16. 11%､19. 40%和17. 68%｡对于R1 和R2，从运行第10 天至15 天连续投加了复合菌剂和负载复合菌剂的填料，所以R1 和R2 中厚壁菌门所占比例从1. 31% 分别升高至6. 13% 和4. 54%；对于R3，由于仅投入活性污泥种泥，其中的厚壁菌门所占比例在运行45 d 仅有0. 95%｡这说明地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis） O1 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） Y5 所属的厚壁菌门虽然具有较强的耐盐性，但不具备竞争优势，通过复合菌剂投加，可以在活性污泥总富集，并成为优势种属[19]｡
4 组实验的微生物群落结构热图和主成分分析是基于各样品中含量前10 位菌属共计34 种菌属（ 如图6 和7 所示）｡根据主成分分析的聚类结果，可以将R1 和R2 的启动分为3 个阶段，这与反应器运行的状况相吻合｡第一阶段（1 ~ 15 d），反应器中活性污泥还处于适应期，进水为普通生活污水，主要以变形菌门中，如不动杆菌属（Acinetobacter）､布兰汉氏菌属（Alkanindiges）､嗜门菌属（Methylophius） 和生丝微菌属（Hyphomicroblum）等占优势；第二阶段（15 ~ 25 d），开始以高盐废水为进水，此时盐度的冲击负荷使得微生物群落结构反生改变，变形菌门中的微生物丰度进一步增加，并达到最大丰度；第三阶段（25 ~ 45 d），经过一段时间的运行和驯化，拟杆菌门中，如鸟杆菌属（Gelidibacter）､黄杆菌属（Flavobacterium）､碳酸噬胞菌属（Aequorivita）等逐渐成为优势种属，而变形菌门中的微生物丰度下降｡
有趣的是，由于复合菌剂和菌填料的投加，第二阶段芽孢杆菌属（Bacillus） 的丰度上升，并在之后的运行中逐渐成为优势种属，而这一阶段R1 与R2 对TOC 的去除率也远高于R3，因此，复合菌剂的投加对改善生物工艺有机物去除效果，缩短启动时间具有显著的效果[11-12，14-15，19]｡
3 结论
1）O1 和Y5 两株菌均具有很强的耐盐能力，能够在高盐环境下生存，并且通过复配能够获得较高的有机物降解率｡投菌量由10% 增加至15%，达到相同TOC 去除率的时间没有大幅度缩短，最大去除率也没有提高，说明投加量增加到一定程度后，对系统降解速度和降解效果影响变化不大｡
2）实验组经连续多次投加耐盐高效菌制备的复合菌剂的SBR 能够在30 d 完成快速启动，并且在启动过程中，TOC 的去除率都能够稳定保持在80% 左右｡此外，通过投加负载复合菌剂的菌填料进行生物强化，能够获得更长的时效行，并且具备更强的抗冲击负荷的能力｡基于较好的有机污染物出去效果和较强的抗盐度冲击能力，本研究制备的复合菌剂用于改善生物处理工艺启动期TOC 的去除率，缩短生物处理工艺的启动时间具有显著的效果｡若能够进一步与耐盐硝化菌和耐盐反硝化菌复合，制备多种功效的复合菌剂，在强化TOC 去除的基础上，强化生物工艺的总氮去除效果，将更具有实际应用价值和工程意义｡
3）实验结果表明复合菌剂的引入导致系统内菌群竞争优势的变化，使整个系统快速适应水质变化，处理效率提高，而通过启动完成后的生物群落结构分析可以看到所投加的耐盐高效菌O1 和Y5 在活性污泥微生物总量中所占比例由1. 31%升高至6. 13%，说明O1 和Y5 能够在小试SBR 中长期存留，并逐渐成为优势种属之一｡
本文转自“乾来环保”
原标题：耐盐复合菌剂强化生物工艺处理高盐废水的快速启动
